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重疊延伸PCR

2019.3.27

重疊延伸PCR技術(shù)主要用于獲得其它依靠限制性?xún)?nèi)切酶消化方法難以得到的產(chǎn)物。可用于：（1）基因的定點(diǎn)突變；（2）融合基因的構(gòu)建；（3）長(zhǎng)片段基因的合成；（4）基因敲除以及目的基因的擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)方法原理	重疊延伸PCR技術(shù)（gene splicing by overlap extension PCR，簡(jiǎn)稱(chēng)SOE PCR）由于采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái)。
實(shí)驗(yàn)材料	基因樣品
試劑、試劑盒	PCR擴(kuò)增酶擴(kuò)增酶Buffer dNTP 引物
儀器、耗材	PCR儀
實(shí)驗(yàn)步驟	1. ?以引物a/b進(jìn)行pcr1。 2. ?以引物c/d進(jìn)行pcr2。 3. ?引物b/c中引入了需要的限制性位點(diǎn)。 4. ?混合二者pcr產(chǎn)物，混合以前最好回收一下。 5. ?進(jìn)行pcr延伸反應(yīng)，只有右面這個(gè)可以延伸。 6. ?以延伸反應(yīng)的產(chǎn)物為模板，以a/d為引物進(jìn)行pcr。 7. ?產(chǎn)物即為所需最終產(chǎn)物。收起?
注意事項(xiàng)	盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意： 1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套； 2. 使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染； 3. 避免反應(yīng)液飛濺，打開(kāi)反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面； 4. 操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度； 5. 最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管； 6. 操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性； 7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該專(zhuān)用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)； 8. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。?