【干貨】小談T載體
小談T載體
目前市場上TA克隆的種類繁多，各大廠家都推出自己各具特色的TA克隆試劑盒。對于科研工作者來說，這些TA克隆試劑盒之間有何區(qū)別？又該如何選擇適合自己的TA克??？
今天，小編就帶著這兩個問題來和大家一起了解一下。
T載體的定義
T載體（T-Vector）是一種高效克隆 PCR 產(chǎn)物（TA克隆）的專用質(zhì)粒載體，為線性化載體，無需酶切可直接與具有A末端的PCR產(chǎn)物連接，屬于非定向克隆。
T載體的作用原理
大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時都具有在PCR產(chǎn) 物的3’末端添加一個“A”的特性。因此，人們在線性化平末端載體的兩端分別又人工加上一個額外的T堿基，從而可與PCR克隆產(chǎn)物的A末端互補(bǔ)配對，提高了PCR產(chǎn)物連接和克隆的效率。
T載體的制備
? 商業(yè)化T載體：
一般來說，商業(yè)化的T載體多是先使用平端限制性內(nèi)切酶（如EcoRV）將克隆載體進(jìn)行線性化，然后再單獨(dú)加入dTTP和Taq酶72～75℃反應(yīng)，進(jìn)行末端的加T。
? 自制T載體：
一種常見的自制方法是利用限制性內(nèi)切酶制造出具有單個T末端突出的片段，最常用的內(nèi)切酶為XcmI，其識別和切割特點(diǎn)如下：
5’……C C A N N N N N▼N N N N T G G……3’
3’……G G T N N N N▲N N N N N A C C……5’
其中XcmI的識別序列分別為兩端的CCA和TGG，而切割序列則為中間三角箭頭所指的N（N代表任意堿基）。由于N可以是任意堿基，所以如果將切割位置的N設(shè)置為T，那么在該酶的切割下，就可以產(chǎn)生一個3’T末端。相似的，在其互補(bǔ)鏈上設(shè)置另一個相同或者類似的XcmI酶切位點(diǎn)（保證切割位點(diǎn)為T即可）就可以產(chǎn)生另一個T末端。一般可以在商業(yè)化的T載體基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，通過PCR或者合成Oligo的方式插入上述兩個XcmI位點(diǎn)。連接成功的質(zhì)?？砂葱枰孕袛U(kuò)增和保存，使用時用XcmI進(jìn)行完全酶切（這里的酶切必須保證完全，否則載體易自連，所以XcmI酶最好過量，或者適當(dāng)延長消化時間），就可以制備得到T載體。
