通過重疊延伸和基因 SOEing 進行 PCR 突變實驗
試劑、試劑盒 無菌 H2OPCR 緩沖液限制性酶和緩沖液Taq DNA 聚合酶PCR 模板5'和 3'引物dNTP
儀器、耗材 DNA 測序裝置熱循環(huán)儀瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
無菌 H2O
2. 酶和酶緩沖液
10XPCR 緩沖液（Roche)，包含 100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/L，KCl 和 15 mml/LMgCl2(參見 32.3 注釋/評價 4，以決定恰當(dāng)?shù)?Mg2+濃度）。
限制性酶和緩沖液（參見步驟 8 和 32.3 注釋/評價 6）
Taq DNA 聚合酶（Roche)
3. 核酸和寡核苷酸
10X dNTP, 商品出售的 dNTP 溶液（AmershamBiosciences) 是 100umol/L 濃度的儲存液，可以用無菌水稀釋。
PCR 模板（參見 32.3 注釋/評價 3)
5'和 3'引物（參見 32.3 注釋/評價 2）
4. 特殊設(shè)備
DNA 測序裝置（參見 32.3 注釋/評價 6)
熱循環(huán)儀
5. 其他
瓊脂糖，分離 DNA 片段所需的瓊脂糖濃度依賴于需要分離的片段的大小。依經(jīng)驗，0.8%~1% 的 SeaKem GTG 瓊脂糖（Cambrex)(用 1XTAE 配制）一般都能夠令人滿意地分離 0.25~2kb 大小的 DNA 片段。
瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備
GENECLEANⅡ試劑盒（BIO101)
6. 載體和菌株
PCR 產(chǎn)物測序所需的克隆載體和菌株。
二、方法
1. 通過重疊延伸進行 PCR 突變
（1）在獨立的微量離心管中進行 PCR 反應(yīng)生成產(chǎn)物 AB 和 CD(參見圖 32-1)。這些反應(yīng)混合物能夠在室溫下混合。有關(guān)引物和模板濃度可以參見 32.3 注釋/評價 2 和 3。
（2）反應(yīng)進行 30 個循環(huán)（94°C 1min,50°C 1min,72°C 2 min)。
（3）將每個反應(yīng)的所有反應(yīng)物進行瓊脂糖凝膠電泳。
（4）切下目標(biāo)條帶（即產(chǎn)物 AB 和 CD)，用 GENECLEANUⅡ試劑盒回收 DNA 片段。
（5）在一個新的微量離心管中進行重疊延伸反應(yīng)。
這一反應(yīng)對于加入的模扳量不十分敏感。通常每種模板可以使用 10~100ng。引物 a 和 d 也可以在PCR 反應(yīng)的開始就加入。
（6）參照上面的步驟 2 進行 PCR 擴增。
（7）將反應(yīng)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切下目標(biāo)條帶（即產(chǎn)物 AD)，參照步驟 4 回收 DNA片段。
（8）純化的突變產(chǎn)物 AD 隨后可以被適當(dāng)?shù)南拗菩悦杆?，然后連接到一個合適的克隆載體上進行后續(xù)的轉(zhuǎn)化和測序（參見 32.3 注釋/評價 6）。
2. 基因 SOEing
（1）在獨立的微量離心管中進行 PCR 反應(yīng)，以分別產(chǎn)生來自基因 1 的產(chǎn)物 WX 和來自基因 2 的產(chǎn)物 YZ(圖 32-2)。關(guān)于引物和模板的濃度參見 32.3 注釋/評價 2 和 3。
（2）反應(yīng)進行 30 個循環(huán)（94°C lmin,50°C lmin，72°C2 min)。
（3）將每個反應(yīng)的所有反應(yīng)物進行瓊脂糖凝膠電泳。
（4）切下目標(biāo)條帶（即產(chǎn)物 WX 和 YZ), 用 GENECLEANB 試劑盒回收 DNA 片段。
（5）在一個微量離心管中進行 SOEing 反應(yīng)。
（6）參照上面的步驟 2 進行 PCR 擴增。
（7）將反應(yīng)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切下目標(biāo)條帶（即產(chǎn)物 WZ), 參照步驟 4 回收 DNA 片段。
（8）純化的突變產(chǎn)物 WZ 隨后可以被適當(dāng)?shù)南拗菩悦杆?，然后連接到一個合適的克隆載體上進行后續(xù)的轉(zhuǎn)化和測序（參見 32.3 注釋/評價 6）。
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