PCR技術的程序和一般過程
試劑
(1)引物:決定擴增的特異性。根據檢測的DNA不同,選用不同引物,每種病原微生
物都有自己特異的引物。
(2)耐熱的DNA聚合酶:此酶是從耐熱細菌中分離出來的,能耐受高溫90℃-100℃。
(3)10×PCR緩沖液:500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩沖液隨酶一起購買。
(4)5mmol/L dNTP貯備液:將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并,加入滅菌去離子水溶解,用NaOH調pH至中性,分裝每份300μl,-20℃保存。dNTP濃度最好用UV吸收法精確測定?，F(xiàn)用dNTP溶液均有商品化產品。
(5)DNA模板:用處理液將待測標本處理,不同處理方法、操作各異,但目的是暴露標本中被檢測的DNA。
操作程序
過去標準的PCR操作程序是將PCR必需反應成份分別加入一微量離心管中,然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進行循環(huán)擴增。具體如下:
(1)向一微量離心管中依次加入
DNA模板 ?102-105拷貝
引物 ?各1μmol/L
dNTP ? ?各200μmol/L
10×PCR緩沖液 1/10體積
ddH2O 補到終體積(終體積50μl-100μl)
混勻后,離心15s使反應成分集于管底。以上步驟僅在實驗研究用,現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液,引物,ddH2O混合在一起,反應體積為20-25μl,只要試驗人員加入處理好的樣品就可以了。
(2)加石蠟油50-100μl于反應液表面以防蒸發(fā)。置反應管于97℃變性10min。
(3)冷至延伸溫度時,加入1-5u Taq?DNA聚合酶,離心30s使酶和反應液充分混合?，F(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應液中。
(4)PCR的循環(huán)程序為:94℃變性30s,55℃退火20s,然后在72℃延伸30s,共循環(huán)30-35次。最后一次循環(huán)結束后,再將反應管置72℃溫育5min,以確保充分延伸。
PCR尚可用于組織標本DNA的擴增。由于固定組織標本的DNA常發(fā)生降解,就給常用的分析方法如Southern轉印雜交等帶來一定困難。87年Impraim等人首先將PCR技術引入固定包埋組織內DNA分析。他們先從組織標本中提取DNA,再用PCR進行特異性的DNA擴增,應用這種方法,他們成功地從保存30至40年之久的組織標本DNA中擴增了HPV病毒基因片段。但這種方法需要提取DNA,操作比較繁瑣。1988年Shibata等人對Impraim的方法進行了改進。他們將固定包埋的組織塊制成5-10um厚,0.4cm大小的切片。將切片放入容積為500μl的Eppendorf管內。加入400μl二甲苯脫脂,離心除去二甲苯,用400μl 95%乙醇洗去殘余二甲苯。離心除盡乙醇、加入100μlPCR反應基質,將Eppendorf管放入沸水浴中煮10min,然后按前述PCR方法進行DNA擴增。
在應用PCR方法檢測RNA病毒時,首先應將RNA轉化成cDNA才能進行擴增,因為PCR只能對DNA模板進行擴增,我們把這種RNA的PCR反應稱為反轉錄PCR,簡稱RT-PCR。把由RNA轉化成DNA的過程叫做反轉錄,反轉錄需要在反轉錄酶的作用下完成。
