基因工程的載體和工具酶-5
（二）Klenow片段酶
Klenow片段是大腸桿菌聚合酶 I 全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段酶分子，分子量為76KD 。
酶催活性：⑴5’ →3’ 的聚合酶活性
?、?’→5’ 的核酸外切酶活性
Klenow片段的主要用途（利用5’ →3’ 的聚合酶活性）：
⑴修補限制性酶消化DNA形成的3′隱蔽末端
⑵標記DNA片段的末端
底物用［α－32P］－dNTPs
⑶cDNA克隆中第二鏈cDNA的合成
⑷DNA序列的測定
（三）T4 DNA聚合酶
T4DNA聚合酶是從T4噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來的，
1.酶催活性：
⑴5′→3′的聚合酶活性
⑵3 ′→ 5 ′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶 I 的活性高200倍。比Klenow 片段酶強100～1,000倍。
因此，可以綜合利用這兩種活性進行取代合成反應(yīng)：
如果反應(yīng)體系中僅存在一種dNTP或沒有底物時，這時T4DNA聚合酶就會表現(xiàn)出3 ′→ 5 ′外切酶活力，從雙鏈DNA的3′開始降解，直到露出底物dNTP相同的堿基。然后就在此位置發(fā)生合成和取代反應(yīng)。
2.T4DNA聚合酶的用途
(1)利用取代合成反應(yīng)制備探針
(2)標記具有平末端的或具有3’－隱蔽末端的DNA片段
利用較強的3 ′→ 5 ′外切酶活性和 5′→3′聚合活性
(3)用于DNA序列分析
（四）逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）
逆轉(zhuǎn)錄酶 是一種依賴RNA的DNA聚合酶。
此酶首先是1970年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒中發(fā)現(xiàn)的。這兩個課題組的論文都發(fā)在了同一期的《Nature》雜志上。
最普遍使用的是從鳥類骨髓母細胞瘤病毒（AMV）分離出來的。
活性：一種可以有效地將mRNA反轉(zhuǎn)錄成DNA的酶，其產(chǎn)物稱為cDNA(complementary DNA).
主要用途是將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA以制備基因片段。
四、修飾性工具酶
（一）末端轉(zhuǎn)移酶（terminal transferase）
末端轉(zhuǎn)移酶是一類不依賴于DNA模板的DNA聚合酶。
特性：該類酶可以在沒有模板鏈存在的情況下，將核苷酸連接到dsDNA或ssDNA的在3’－OH。特別是對于平末端的雙鏈DNA末端加尾十分有用。
最常見的用途：給外源DNA片段及載體分子加上互補的同聚物尾巴，以創(chuàng)造黏性末端，便于重組。
（二） SI核酸酶（SI nuclease）
這是一種從米曲霉（Aspergillus oryzae）中分離的高度單鏈特異的外切酶。
活性：可以降解單鏈DNA或RNA或雙鏈的單鏈區(qū)。
其主要用途有：
⑴ 在cDNA合成過程中，切開cDNA的發(fā)夾末端；
⑵ 載體構(gòu)建過程中，切去DNA片段的單鏈尾巴，
形成平末端結(jié)構(gòu)。
（三）堿性磷酸酶
從大腸桿菌中分離的細菌堿性磷酸酶（Bacterial Alkaline Phosphatase）簡稱BAP。
從小牛腸中分離的叫小牛腸堿性磷酸酶（ Calf Intestinal Alkaline Phosphatase） ，簡稱CIP，用的廣泛。
酶催功能：
脫磷酸作用，將單鏈或雙鏈DNA或RNA5’－P轉(zhuǎn)化成5’－OH。
其主要用途有：
⑴在用32P標記DNA 5′端之前，去除5′端的磷；
⑵在DNA重組技術(shù)中，去除DNA片段的5′磷酸，防止載體的自身環(huán)化，提高重組子比例。
