PCR擴(kuò)增需要注意的點(diǎn)
1. 引物的質(zhì)量是保證PCR特異性的關(guān)鍵，引物過長或過短均會(huì)使特異性降低，以18～30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內(nèi)部和引物之間不應(yīng)含有互補(bǔ)序列；引物的堿基順序與非擴(kuò)增區(qū)域的同源性應(yīng)小于70%；引物的3’末端與模板DNA一定要配對(duì)，但末端沒有嚴(yán)格的限制，故引物設(shè)計(jì)時(shí)可在5’末端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和/或啟動(dòng)密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產(chǎn)物中的不完整序列、脫嘌呤產(chǎn)物、堿基修飾鏈等“雜質(zhì)”；引物的終濃度一般為0.2～0.5μmol/L，過低會(huì)影響反應(yīng)產(chǎn)量，過高會(huì)增加引物二聚或錯(cuò)配的幾率。2. Taq DNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但無3’-5’外切酶活性，因此對(duì)單核苷酸的錯(cuò)配無校正功能，發(fā)生堿基錯(cuò)配的幾率為 2.1×10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優(yōu)勢在于反應(yīng)產(chǎn)量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經(jīng)基因工程改造后，新創(chuàng)出的Pfu Ultra具有更佳的校驗(yàn)活力。數(shù)據(jù)顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯(cuò)配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶(保真度＝1/錯(cuò)誤率) (數(shù)據(jù)來源：美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室)。3. Mg2+濃度也是影響反應(yīng)效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對(duì)Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結(jié)合，不同反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5～1.0mmol/L為宜，Mg2+過量能增加非特異擴(kuò)增。4. dNTP的濃度過高會(huì)增加堿基的錯(cuò)誤摻入率，使反應(yīng)特異性下降；過低則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度下降。使用時(shí)4種dNTP必須以等當(dāng)量濃度配制，均衡的dNTP有利于減少錯(cuò)配誤差和提高使用效率。5. 溫度循環(huán)參數(shù)中應(yīng)特別注意復(fù)性溫度，它決定引物與模板的特異性結(jié)合。退火復(fù)性溫度可根據(jù)引物的長度，通過Tm＝4(G+C)+2(A+T) 計(jì)算得到。在Tm允許的范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結(jié)合。6. 減低污染的常規(guī)措施：①將PCR試劑、PCR產(chǎn)物及其他分子生物學(xué)試劑分開放置；②應(yīng)保持樣品制備、PCR反應(yīng)液配制與PCR產(chǎn)物分析三個(gè)工作區(qū)的獨(dú)立性；③使用陽性和陰性對(duì)照；④使用最高質(zhì)量的水配制PCR實(shí)驗(yàn)的所有反應(yīng)試劑；⑤配制好的PCR反應(yīng)試劑應(yīng)分成小包裝儲(chǔ)存，每個(gè)包裝僅用于單次實(shí)驗(yàn)；⑥制備樣品、配制試劑及反應(yīng)液時(shí)必須戴手套；⑦實(shí)驗(yàn)前一定要認(rèn)真清潔加樣器等。
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焦點(diǎn)事件
