CRISPR/Cas9：基因編輯的歷史與發(fā)展
CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古菌特有的一種天然防御系統(tǒng)，用于抵抗病毒或外源性質(zhì)粒的侵害。當(dāng)外源基因入侵時(shí)，該防御系統(tǒng)的 CRISPR 序列會(huì)表達(dá)與入侵基因組序列相識(shí)別的 RNA，然后 CRISPR 相關(guān)酶(Cas)在序列識(shí)別處切割外源基因組DNA，從而達(dá)到防御目的。
根據(jù)Cas蛋白的特點(diǎn)，可將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)需要借助復(fù)雜的蛋白復(fù)合體發(fā)揮作用，Ⅱ型系統(tǒng)僅借助 Cas9蛋白和sgRNA即可對(duì)靶目標(biāo)進(jìn)行編輯，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作容易，因此目前主要使用Ⅱ型CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。
CRISPR/Cas自誕生以來(lái)，迅速發(fā)展，已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域最耀眼、最有前景的技術(shù)。尤其是近兩年，在全世界科學(xué)家的共同努力下，CRISPR/Cas相關(guān)新進(jìn)展新突破不斷涌現(xiàn)。
一、基因編輯技術(shù)的發(fā)展史
基因編輯可以分為三代，第一代：ZFN；第二代：TELEN；第三代：CRISPR/Cas。這三個(gè)基因編輯技術(shù)都利用了DNA修復(fù)機(jī)制，所以我們先來(lái)了解一下DNA修復(fù)機(jī)制（?圖1?）。[圖片上傳失敗...(image-8dab49-1625385468208)]
圖1-NHEJ修復(fù)（左），HDR修復(fù)（右）
NHEJ（Non-homologous end joining）
非同源性末端接合
NHEJ修復(fù)機(jī)制不需要任何模版，修復(fù)蛋白直接將雙股裂斷的DNA末端彼此拉近，在DNA連接酶的幫助下重新接合（?圖1?）。
HDR（Homology directed repair）
同源重組修復(fù)
當(dāng)細(xì)胞核內(nèi)存在與損傷DNA同源的DNA片段時(shí)，HDR才能發(fā)生。
NHEJ的機(jī)制簡(jiǎn)單又不依靠模版，因而NHEJ的活性相對(duì)于HDR高出許多。但NHEJ修復(fù)出錯(cuò)的概率較高，容易造成移碼突變等，基因編輯正是利用了這一點(diǎn)（?圖1?）。
1.ZFN的識(shí)別切割機(jī)制
融合鋅指模塊和FokI切割結(jié)構(gòu)域形成ZFN ；以二聚體的形式靶向切割每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)；特異識(shí)別3個(gè)堿基 ；組裝多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)(識(shí)別12-18bp)形成的ZFN對(duì)可特異切割基因組靶點(diǎn) （?圖2?）。
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圖2-ZFN基因編輯原理圖
2.TALEN的識(shí)別切割機(jī)制
兩個(gè)TALE靶向識(shí)別靶點(diǎn)兩側(cè)的序列；每個(gè)TALE融合一個(gè)FokI內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域；FokI通過(guò)TALE靶向形成二聚體切割靶點(diǎn)；設(shè)計(jì)靈活識(shí)別特異性強(qiáng)（?圖3?）。
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圖3-TELEN基因編輯原理圖
3.CRISPR/Cas9的識(shí)別切割機(jī)制
crRNA通過(guò)堿基配對(duì)與 tracrRNA結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA 復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈 DNA（?圖4?）。
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圖4-CRISPR/Cas9基因編輯原理圖
ZFN、TELEN、CRISPR/Cas9比較
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圖5-三種基因編輯的比較
二、CRISPR/Cas技術(shù)的介紹
CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)
1987年，在大腸桿菌的基因組中首次發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特殊的重復(fù)間隔序列——CRISPR序列，隨后，在其他細(xì)菌和古菌中也發(fā)現(xiàn)了這一特殊序列。
2005年，發(fā)現(xiàn)這些CRISPR序列和噬菌體的基因序列匹配度很高，說(shuō)明CRISPR 可能參與了微生物的免疫防御。
2011年，CRISPR/Cas系統(tǒng)的分子機(jī)制被揭示：當(dāng)病毒首次入侵時(shí)，細(xì)菌會(huì)將外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的間隔區(qū)；病毒二次入侵時(shí)，CRISPR 轉(zhuǎn)錄生成 前體crRNA (pre-crRNA)， pre-crRNA 經(jīng)過(guò)加工形成含有與外源基因匹配序列的crRNA，該crRNA與病毒基因組的同源序列識(shí)別后，介導(dǎo) Cas 蛋白結(jié)合并切割，從而保護(hù)自身免受入侵。
2013年，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)可高效地編輯基因組。隨后張鋒等使用CRISPR系統(tǒng)成功的在人類細(xì)胞和小鼠細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因編輯。
從此開(kāi)始，CRISPR/Cas9技術(shù)給生命科學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)了巨大沖擊，CRISPR/Cas9相關(guān)研究成果頻頻登上CNS等頂級(jí)期刊，近兩年更是成為諾貝爾獎(jiǎng)熱門候選。
CRISPR/Cas技術(shù)的原理
CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通過(guò)堿基配對(duì)與 tracrRNA（trans-activating RNA ）結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA 復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈 DNA。而通過(guò)人工設(shè)計(jì) crRNA 和 tracrRNA 這兩種 RNA，改造成具有引導(dǎo)作用的sgRNA （single guide RNA ），從而引導(dǎo) Cas9 對(duì) DNA 的定點(diǎn)切割（圖4）。
CRISPR/Cas技術(shù)的優(yōu)勢(shì)
設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，簡(jiǎn)明的堿基互補(bǔ)設(shè)計(jì)原則，識(shí)別不受基因組甲基化影響，能靶向幾乎任意細(xì)胞任意序列，方便同時(shí)靶向多個(gè)靶點(diǎn)，切割效率高。
三、CRISPR/Cas的脫靶效應(yīng)
PAM**** (Protospacer adjacent motif )
前間區(qū)序列鄰近基序
PAM序列區(qū)是CRISPR/Cas9系統(tǒng)行使切割功能的基本條件。如果靶序列 3′端沒(méi)有PAM序列，即使靶序列與sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不會(huì)切割該序列位點(diǎn)。 PAM序列主要影響CRISPR/Cas9的DNA切割效率。在細(xì)胞水平上，NGG介導(dǎo)的切割效率是最高的。
sgR****NA ****(Single guide RNA )
向?qū)?RNA
sgRNA與目標(biāo)基因組相結(jié)合的 20nt 序列區(qū)決定著 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的靶向特異性。CRISPR/Cas9與靶位點(diǎn)識(shí)別的特異性其實(shí)主要依賴于sgRNA與靠近PAM區(qū)的10~12 bp的堿基配對(duì)，而其余遠(yuǎn)離PAM序列 8~10 bp 堿基的錯(cuò)配對(duì)靶位點(diǎn)識(shí)別的影響并不明顯。目前研究結(jié)果均提示，可能靠近 PAM 的 8~14 bp 序列是決定特異性的關(guān)鍵，其他序列也均在不同程度上影響脫靶效應(yīng)。
CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)給研究帶來(lái)了一定程度上的不確定性，也是限制其發(fā)揮更大潛力的主要原因之一。
2017年5月30日，?Nature?雜志子刊?Nature Methods?刊登了美國(guó)哥倫比亞大學(xué)研究人員的一篇文章，研究人員通過(guò)CRISPR/Cas9成功修復(fù)了導(dǎo)致小鼠失明的基因后，對(duì)小鼠進(jìn)行全基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)修復(fù)后的小鼠基因組有超過(guò)1500個(gè)單核苷酸突變，以及超過(guò)100個(gè)位點(diǎn)發(fā)生大片段插入或缺失（?圖6?）。文章的結(jié)論無(wú)疑引發(fā)了巨大震動(dòng)，也給正在進(jìn)行中的CRISPR/Cas9帶來(lái)了不確定性。
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圖6--動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中CRISPR/Cas9編輯后發(fā)生意想不到的突變
仔細(xì)分析后，發(fā)現(xiàn)該文章并不十分嚴(yán)謹(jǐn)，文章僅有兩只小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，一只作為對(duì)照組，數(shù)量不足以證明結(jié)論是否只是個(gè)例。而且單堿基突變是生物體內(nèi)自然現(xiàn)象，不能全歸于CRISPR/Cas9。整個(gè)實(shí)驗(yàn)只基于一個(gè)sgRNA數(shù)據(jù)，且該sgRNA特異性評(píng)分很低，造成脫靶效應(yīng)也應(yīng)該在預(yù)料之中（?圖7?）。
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圖7--針對(duì)?Nature Methods?文章的回應(yīng)
經(jīng)過(guò)一系列的研究和改進(jìn)，目前CRISPR系統(tǒng)的脫靶性已經(jīng)很低，當(dāng)然，要想達(dá)到理想的狀態(tài)，還有很長(zhǎng)的路要走。
四、CRISPR/Cas技術(shù)的進(jìn)展
2016年6月，張鋒在?Science?發(fā)表文章，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas13a能有切割細(xì)菌的特定RNA序列。
2016年9月，Jennifer Doudna在?Nature?發(fā)表文章，證實(shí)CRISPR/Cas13a可以用于RNA檢測(cè)。
2017年2月22日，美國(guó)紀(jì)念斯隆.凱特林癌癥中心（MSK）研究人員在?Nature?雜志發(fā)文，使用腺相關(guān)病毒（AAV）介導(dǎo)，將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于CAR-T療法。該研究既解決了傳統(tǒng)CAR-T療法的隨機(jī)整合可能存在的潛在危害，又大大降低了CAR-T細(xì)胞發(fā)生分化或癌化的風(fēng)險(xiǎn)，賦予了CAR-T技術(shù)全新的高效性、穩(wěn)定性、安全性。
2017年8月2日，Shoukhrat Mitalipov在?Nature?發(fā)表長(zhǎng)文，使用CRISPR/Cas9技術(shù)修正了植入子宮前的人類胚胎中一種和遺傳性心臟病有關(guān)的變異。該研究證實(shí)了通過(guò)編輯人類胚胎進(jìn)行治療遺傳病是安全可行的。值得一提的是，該成果受到了基因編輯領(lǐng)域大牛George Church等人的質(zhì)疑。
2017年8月11日，楊璐菡等在?Science?發(fā)表文章，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)敲除豬基因組中的內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒（PERV）序列，并克隆出多只PERV失活小豬。向最終實(shí)現(xiàn)使用豬器官進(jìn)行人體器官移植的終極目標(biāo)邁進(jìn)了一大步。
2017年9月，雜交水稻之父”袁隆平院士宣布使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除與鎘吸收和積累相關(guān)基因的水稻育種成功。該研究從根本上解決了水稻鎘污染的問(wèn)題，將扭轉(zhuǎn)我國(guó)部分農(nóng)作物重金屬超標(biāo)的問(wèn)題，進(jìn)而改善部分人群重金屬慢性中毒的問(wèn)題。
2017年10月4日，張鋒在?Nature?發(fā)表論文證實(shí)CRISPR/Cas13a能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中編輯特定的RNA。CRISPR/Cas13a能夠達(dá)到RNAi相似的降低基因表達(dá)的效率，而且有更強(qiáng)的特異性，且對(duì)細(xì)胞內(nèi)天然的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響更小。
2017年10月19日，Jennifer Doudna在?Nature?發(fā)表文章，設(shè)計(jì)了高精確性的Cas9變體—HypaCas9。該研究極大地降低了Cas9的脫靶效應(yīng)，且不降低靶向切割效率。
2017年10月25日，張鋒在?Science?發(fā)表文章介紹CRISPR新系統(tǒng)--REPAIR，可以高效的進(jìn)行RNA的單堿基修復(fù)。因?yàn)椴桓淖僁NA序列，所以為通過(guò)基因編輯治療遺傳病而又不永久影響基因組提供了新可能。
2017年10月25日，哈佛大學(xué)Broad研究所的David Liu實(shí)驗(yàn)室在?Nature?發(fā)表長(zhǎng)文，報(bào)道了新型腺嘌呤基因編輯器——ecTadA-dCas9，可以將A·T堿基對(duì)轉(zhuǎn)換成G·C堿基對(duì)，該技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)了不依賴DNA斷裂即可進(jìn)行基因編輯的技術(shù)，即單堿基基因編輯技術(shù)。該技術(shù)高于其它基因組編輯方法的效率，且?guī)缀鯖](méi)有隨機(jī)插入、刪除或其它突變等不良副作用，因此為今后大范圍治療點(diǎn)突變遺傳疾病提供了極大的便利。
五****、展望
近幾年CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)飛速發(fā)展，推廣應(yīng)用到了生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)以及環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域，造就了一批批科研奇跡，尤其是在遺傳病的治療、疾病相關(guān)基因的篩查與檢測(cè)、腫瘤治療以及動(dòng)植物的改造、病原微生物防治等領(lǐng)域有著巨大的潛力，也將深遠(yuǎn)地影響整個(gè)世界。
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焦點(diǎn)事件
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焦點(diǎn)事件
