奶品中三聚氰胺的常規(guī)檢測(cè)和GCMS確證（二）
圖1(反相).? 三聚氰胺標(biāo)樣圖譜。
儀器、試劑與材料
儀器：本實(shí)驗(yàn)使用Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀系統(tǒng)，含LC-20AD輸液泵，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱，SPD-20A紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，CBM-20A控制器，DGU-20A3在線脫氣機(jī)。另外，還使用到如下設(shè)備：高速離心機(jī)（轉(zhuǎn)速可達(dá)到10000r/min以上）、漩渦混合器、超聲波清洗器、氮吹儀（控溫60℃以上）、固相萃取裝置、震蕩搖床。
圖2(反相).? 5μg/ml標(biāo)樣連續(xù)5針進(jìn)樣重疊圖譜。
試劑：甲醇，色譜純：乙腈，色譜純：氨水，濃度25%~28%；混合性陽(yáng)離子交換固相萃取柱，60mg，3ml；三氯乙酸溶液10g/L，稱取10g三氯乙酸加水至1000ml；氨水甲醇溶液，量取5ml氨水，溶解于100ml甲醇中；乙酸鉛溶液22g/L，取22g乙酸鉛用約300ml水溶解后定容至1L；乙腈溶液，75ml乙腈加入25ml純水，混勻；緩沖液，配制含10mM檸檬酸和10mM辛烷磺酸鈉的緩沖液，調(diào)節(jié)pH值到3.0；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）。
流動(dòng)相：將緩沖液與甲醇按照7:3比例混合，用0.45μm的濾膜過(guò)濾后備用。
三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取50mg（精確到0.1mg）的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶液溶解并定容于100ml容量瓶中，該溶液濃度為0.5mg/ml，于4℃冰箱內(nèi)貯存，有效期3個(gè)月。
圖3(反相).? 校準(zhǔn)曲線。
三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用緩沖液稀釋成濃度為0.5μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液。于4℃冰箱內(nèi)貯存，有效期1周。
樣品前處理
（1）提取
奶粉樣品取樣5g，準(zhǔn)確加入50ml三氯乙酸溶液，加入2ml乙酸鉛溶液搖勻，超聲提取20min，轉(zhuǎn)入離心管，在10000r/min離心機(jī)上離心5min，取上清液。
圖4(反相).? 空白奶粉。
（2）凈化
分別用3ml甲醇，3ml水活化混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱，取上清液分次上柱，控制過(guò)柱速度在1ml/min以內(nèi)。再用3ml水和3ml甲醇洗滌混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱，抽近干后用氨水甲醇溶液3ml洗脫。洗脫液50℃氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入緩沖液，漩渦振蕩1min，0.45um濾膜過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定。
表1(反相).? 保留時(shí)間與峰面積的重現(xiàn)性（方法精密度驗(yàn)證）
色譜分離條件
本實(shí)驗(yàn)所用色譜柱為GL Sciences C8 4.6×250mm 5um；檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為235nm；流速1ml/min；柱溫 40℃；進(jìn)樣量為10μl；等度洗脫。
表2(反相).? 3個(gè)不同濃度樣品回收率
流動(dòng)相配制方法如下：首先配制含10mM檸檬酸和10mM辛烷磺酸鈉的緩沖液，調(diào)節(jié)pH值到3.0。將緩沖液與甲醇按照7:3比例混合，用0.45μm的濾膜過(guò)濾后備用。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程與結(jié)果
三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1mg/ml）：準(zhǔn)確稱量100.6mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100ml容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并準(zhǔn)確定容至刻度，并用0.45μm的濾膜過(guò)濾，備用。
圖5(反相).? 空白奶粉加入0.5mg/kg三聚氰胺。
（1）保留時(shí)間與峰形
圖1為本方法檢測(cè)三聚氰胺標(biāo)樣的典型色譜圖（樣品濃度為1μg/ml），由圖1可見(jiàn)，本方法所測(cè)三聚氰胺保留時(shí)間為11.02min，峰形尖銳，對(duì)稱性好。
（2）標(biāo)樣精密度
取濃度為5μg/ml三聚氰胺標(biāo)樣，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果如表1所示，由表1結(jié)果可見(jiàn)，本方法測(cè)定三聚氰胺具有很好的精密度和重現(xiàn)性。5針圖譜如圖2所示。
（3）線性關(guān)系
取標(biāo)準(zhǔn)工作液分別進(jìn)樣，得到校準(zhǔn)曲線如圖3所示，相關(guān)系數(shù)為0.9999，線性度良好。
（4）加樣回收率
取奶粉空白樣品，分別加入適量三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，使其三聚氰胺終濃度分別為0.5mg/kg，5mg/kg和50mg/kg，另外取陽(yáng)性樣品一個(gè)，共一個(gè)空白和四個(gè)樣品。空白稱量一份，每個(gè)樣品各稱量?jī)煞?，總?份，按照樣品前處理方法進(jìn)行提取純化。結(jié)果如圖4、5、6、7所示。
圖6(反相).? 空白奶粉加入5mg/kg三聚氰胺。
從圖中看出，空白奶粉也檢測(cè)出少量三聚氰胺。由于本次實(shí)驗(yàn)時(shí)間限制，無(wú)法挑選到一個(gè)合格的空白奶粉。這是可以改進(jìn)的地方。
表3(反相).? 保留時(shí)間與峰面積的重現(xiàn)性
計(jì)算3個(gè)不同濃度樣品回收率如表2所示。
由表2可見(jiàn)，本方法檢測(cè)三聚氰胺回收率一般。這是由于實(shí)驗(yàn)條件限制，無(wú)法對(duì)50ml以上液體進(jìn)行一次性離心，因此稱取的樣品量和加入的試劑量均為標(biāo)準(zhǔn)提取方法的十分之一，即稱取0.5g奶粉，加入5ml三氯乙酸溶液和0.2ml乙酸鉛溶液。氮吹儀吹干后，加入0.5ml緩沖液溶解。如果實(shí)驗(yàn)條件改進(jìn)，回收率能有很大改進(jìn)。
圖7(反相).? 空白奶粉加入50mg/kg三聚氰胺。
（5）樣品結(jié)果重現(xiàn)性
取加樣量為5mg/kg樣品，提取純化后，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果如表3所示。
由表3結(jié)果可見(jiàn)，本方法測(cè)定樣品中三聚氰胺具有很好的重現(xiàn)性。
（6）檢測(cè)限
用軟件計(jì)算出檢測(cè)限和定量限如表4所示。
表4(反相).? 軟件計(jì)算出的檢測(cè)限和定量限（μg/ml）
結(jié)論
通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，本方法具有操作簡(jiǎn)單方便，靈敏度高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于奶粉中三聚氰胺含量的檢測(cè)。
