質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)步驟
質(zhì)粒DNA提取可以：(1)快速純化質(zhì)粒;(2)用于測(cè)序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、限制性內(nèi)切酶消化、細(xì)菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法原理質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作，進(jìn)行遺傳工程改良物種等工作時(shí)最主要的DNA載體。
提取質(zhì)粒的基本步驟分為三步：
?、偌?xì)菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴(kuò)增
?、诩?xì)菌菌體的裂解
③質(zhì)粒DNA的純化
實(shí)驗(yàn)材料 大腸桿菌
試劑、試劑盒 Tris-Hcl EDTA 葡萄糖 NaOH KAac NaAc 異丙醇 溶菌酶 酚:氯仿 無(wú)水乙醇 LB培養(yǎng)基
儀器、耗材 超凈工作臺(tái) 培養(yǎng)箱 搖床 恒溫水浴鍋 臺(tái)式離心機(jī) 取液器 低溫冰箱 冷凍真空干燥機(jī)電泳儀 水平電泳槽 紫外觀測(cè)儀
實(shí)驗(yàn)步驟 一、材料與試劑準(zhǔn)備
1. 材料：大腸桿菌。
2. 儀器：超凈工作臺(tái)，培養(yǎng)箱，搖床，恒溫水浴鍋，臺(tái)式離心機(jī)，取液器一套，低溫冰箱，冷凍真空干燥機(jī)，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀測(cè)儀。
3. 試劑：
(1)Solution I ：25 mM Tris-Hcl(pH7.4)，10 mM EDTA(pH8.0)，50 mM葡萄糖，高壓滅菌，4℃保存。
(2)Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 現(xiàn)配現(xiàn)用。
(3)Solution III ：5 N KAc pH4.8，高壓滅菌，4℃保存。
(4)3 M NaAc pH5.2，高壓滅菌，4℃保存。
(5)異丙醇，溶菌酶(8 mg/ml)，酚/氯仿，無(wú)水乙醇，70%乙醇，LB培養(yǎng)基，電泳試劑。
二、操作步驟
1. 細(xì)菌繁殖：LB培養(yǎng)基，2 ml/20 ml，37℃，200 rpm，搖一搖，過(guò)夜。
2. 離心10 min，5 000 rpm， 4℃;棄上淸液。
3. 沉淀(菌體細(xì)胞)預(yù)冷的TES緩沖液洗滌，離心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入預(yù)冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。
4. 重新懸浮，加入150 ul溶菌酶母液，室溫放置5 min。
5. 加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。
6. 加入0.9 ml預(yù)冷乙酸鉀，混勻，離心10 min，12 000 rpm，4℃。
7. 加入1.5 ml異丙醇，-20℃冰箱內(nèi)放置15 min。
8. 離心10 min，12 000 rpm，4℃。
9. 取沉淀，懸于400 ul TE緩沖液中。
10. 加入40 ul，3 M NaAc。
11. 酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。
12. 離心10 min，12 000 rpm，4℃。
13. 取沉淀，冷凍干燥，再懸浮于50 ul TE緩沖液中。
14. 電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量。
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技術(shù)原理
