分子生物學(xué)課程教學(xué)講義（六）
4． DNA序列分析
a. Sanger的雙脫氧鏈終止法
Cambridge的F. Sanger在1977年發(fā)明用雙脫氧鏈終止法測(cè)定單鏈DNA的序列，其基本原理如下：
①DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈；②該酶能夠用2'，3'--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3'-末端，從而終止其延伸反應(yīng)。在DNA測(cè)序反應(yīng)中，加入模板DNA，引物（特異性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一種ddNTP。常用Klenow大片段，無5'→3'外切酶活性。
b． Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法(哈佛大學(xué))
該方法的基本原理是用化學(xué)試劑處理具有末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割并產(chǎn)生一組具有不同長度的DNA鏈降解產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影之后，可直接讀出待測(cè)DNA片段的核苷酸序列。
該反應(yīng)的關(guān)鍵在于使DNA的4種核苷酸中，只有1-2種發(fā)生特異性的化學(xué)切割反應(yīng)：
堿基的特異性修飾；
被修飾的堿基從核糖環(huán)上轉(zhuǎn)移；
失去堿基的糖環(huán)部位發(fā)生DNA鏈斷裂。
專門用來對(duì)核苷酸作化學(xué)修飾，并打斷磷酸二酯鍵的化學(xué)試劑有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。
硫酸二甲酯是堿性化學(xué)試劑，能使DNA鏈中鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位發(fā)生甲基化，在中性PH環(huán)境中就能使糖苷鍵發(fā)生水解，并引起DNA鏈的斷裂。在堿性條件下，肼能特異性切割C和T。如果加入1 mol/L的Nacl，那么，只有C被特異性切割。
c． DNA序列分析自動(dòng)化
用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作為熒光劑標(biāo)記DNA引物，帶有這種引物的DNA片段能在激光誘導(dǎo)下發(fā)出熒光。按照標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧終止法或化學(xué)終止法進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，跑DNA凝膠后用計(jì)算機(jī)檢測(cè)。
d.DNA雜交測(cè)序法(SBH-Sequencing by hybridization)
如果一段較短的DNA探針能與較長的DNA片段雜交，并形成完全的雙鏈結(jié)構(gòu)，我們就推測(cè)在靶DNA上存在著相應(yīng)的互補(bǔ)序列，這就是DNA雜交測(cè)序法的基本原理。如果將一種12-mer的靶DNA與完全隨機(jī)合成的8-mer寡核苷酸控針混合雜交，在總數(shù)為48=65536種8-mer的控針群體中，僅有5種探針會(huì)與靶DNA雜交，形成完全互補(bǔ)的雙鏈分子。
當(dāng)靶DNA與標(biāo)記探針形成G-T或G-A末端堿基錯(cuò)配的雙鏈體時(shí)，檢測(cè)有一定難度。寡核苷酸探針越短，堿基錯(cuò)配造成的去穩(wěn)定效應(yīng)越明顯，較易與完全的雙鏈體分子相區(qū)分。但是，探針短，雜交產(chǎn)物的總體穩(wěn)定性下降，信/噪比下降，影響結(jié)果的可靠性。所以，6-mer寡核苷酸矩陣芯片只能用于測(cè)定500bp的靶DNA；7-mer=2000bp，8-mer=8000bp。
SBH的應(yīng)用：
① 可有效檢測(cè)靶DNA中的單堿基突變；
② 可用于不同DNA片段之間的序列比較；
③ 可用于檢測(cè)不同生長發(fā)育狀態(tài)下細(xì)胞中特定基因的表達(dá)狀況；
④ 可用于檢驗(yàn)傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)的準(zhǔn)確性。
5． 基因的定點(diǎn)誘變（site-directed mutagenesis）
使已克隆基因或DNA片段中的任何一個(gè)特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失變化的過程叫作基因的定點(diǎn)誘變，是基因工程和蛋白質(zhì)工程的重要手段。
a. 盒式誘變(cassette mutagenesis)，包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。
b．寡核苷酸引物誘變
應(yīng)用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段做引物，進(jìn)行DNA復(fù)制，使寡核苷酸引物成為新合成的DNA子鏈的一個(gè)部分。
C．PCRG與PCR誘變
6． 利用DNA與蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行核酸研究.
a.凝膠滯緩實(shí)驗(yàn)(Gel retardation assay)，又稱DNA遷移率變化試驗(yàn)(DNA mobility shift assay--EMSA)。
b． DNase I 印跡試驗(yàn)（DNase I foot printing）
主要步驟：
① 用32P標(biāo)記DNA雙鏈末端，并用RE切去一端；
② 加入細(xì)胞特定周期蛋白質(zhì)提取物，溫育；
③ 加入適量DNaseI或硫酸二甲酯-六氫吡啶，使DNA鏈發(fā)生斷裂。
這一反應(yīng)中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常關(guān)鍵，要保證一條鏈只發(fā)生一次斷裂！
④沉淀DNA（包括與DNA相結(jié)合的蛋白質(zhì)）；
⑤進(jìn)行DNA凝膠分析。
如果某個(gè)蛋白質(zhì)已經(jīng)與DNA的特定區(qū)段相結(jié)合，那么，它就會(huì)保證該區(qū)段DNA免受消化或降解作用。在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位不產(chǎn)生放射性標(biāo)記的條帶。
c． 甲基化干擾試驗(yàn)(Methylation interference assay)
用DMS處理靶DNA，使平均每條鏈上只有一個(gè)G被甲基化。將局部甲基化的DNA與含DNA結(jié)合蛋白的細(xì)胞提取物共溫育后進(jìn)行凝膠滯緩試驗(yàn)。分離各種DNA條帶，并用六氫吡啶切割甲基化的殘基。如果因某個(gè)G殘基的甲基化作用而阻止了蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，那么，六氫吡啶對(duì)這個(gè)甲基化G殘基的切割作用，就只能在沒有蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA中觀察到。
d． 體內(nèi)足跡試驗(yàn)
用適量DMS處理完整的游離細(xì)胞，使染色質(zhì)中的G殘基甲基化，提取DNA并加入六氫吡啶切割DNA鏈。與對(duì)照的裸露DNA經(jīng)甲基化處理后形成的梯度相對(duì)照，就能發(fā)現(xiàn)DNA鏈上的蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)。
三、分子克隆技術(shù)
1、高質(zhì)量mRNA的制備
應(yīng)用Promega
PolyAT tract mRNA Isolation System分離Poly(A)RNA。將Biotinylated
Oligo(dT)引物與細(xì)胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的Streptavidin，用磁場(chǎng)吸附與PMP相連的SA-Biotinylated
Oligo(dT)-mRNA。
2． 反轉(zhuǎn)錄成cDNA
可同時(shí)在反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中加入Oligo（dT）12-18-mer及隨機(jī)引物R6，以保證得到全長cDNA；
應(yīng)選用活性較高的反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse transcriptase）；
應(yīng)選用甲基化dCTP；
應(yīng)保證所獲得雙鏈cDNA的方向性。
Super Script Choice cDNA合成系統(tǒng)中所用的poly（dT）引物
因?yàn)榻^大多數(shù)大腸桿菌細(xì)胞都會(huì)切除帶有5'-methyl C的外源DNA，所以，應(yīng)選用mcrA- mcrB-菌株。
3．分子克隆的主要方法
（1）構(gòu)建cDNA、核DNA文庫，應(yīng)用現(xiàn)有核酸探針分離新的目的基因；
（2）差式雜交(differential screen)和扣除雜交(subtractive hybridization)技術(shù)；
（3）DD-RT-PCR法及差別顯示技術(shù)；
（4）差別分析法 (RDA法，即Representational difference analysis）；
（5）酵母雙雜交體系Two-hybrid system；
（6）圖位克隆法（map-based cloning）與染色體步移 （genomic DNA Walking）。
習(xí)慣上，人們用克隆表示由同一物種具有相同基因型的兩個(gè)或多個(gè)個(gè)體組成的群體。所以，從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotic
twins）便屬于同一克隆。細(xì)胞學(xué)上，克隆是指由同一個(gè)祖細(xì)胞（progenitor
cell）分裂而來的具有同一遺傳背景的子細(xì)胞群體。分子生物學(xué)上，把將外源DNA插入具有自主復(fù)制能力的載體DNA中，使之得以自主復(fù)制和永久保存的過程叫做分子克隆。
文庫篩選與基因豐度有關(guān)。高豐度基因，如蠶絲心蛋白，卵清蛋白等在某些特定組織中可占細(xì)胞總mRNA量的50-90%，非常容易被分離。低豐度基因，一般在細(xì)胞中只有10-20個(gè)拷貝，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可含10,000到40,000種不同的mRNA，如果要達(dá)到99%的期望值，大約需要篩選150,000-170,000個(gè)克隆子。一般情況下，每微克cDNA可產(chǎn)生10萬-60萬個(gè)克隆子。
A.差式雜交或扣除雜交克隆技術(shù)
B.cRNA差式顯示法
除了極少數(shù)特例(如組蛋白基因)之外，幾乎所有的真核基因mRNA分子的3'-末端，都帶有一段多聚的腺苷酸結(jié)構(gòu)，即通常所說的poly(A)尾巴。
P.Liang等人設(shè)計(jì)合成了全部12種不同的引物，用以反轉(zhuǎn)錄mRNA，合成第一鏈cDNA。這種引物通常叫作3'-端錨定脫氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M為除了T以外的任何一種核苷酸（即A、G或C），而N則為任何一種核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12種不同的排列組合方式。
DDRT-PCR的主要步驟：
Ⅰ.從不同發(fā)育階段或不同基因型的細(xì)胞群體中分離mRNA，并以3'錨定引物作為反轉(zhuǎn)錄的引物，合成第一鍵cDNA；
Ⅱ.用5'隨機(jī)引物和某個(gè)3'端錨定引物對(duì)擴(kuò)增第一鏈(摻入32p-dNTP)；
Ⅲ.用DNA變性測(cè)序膠分離擴(kuò)增產(chǎn)物，X光片曝光后檢測(cè)差別條帶；
Ⅳ.回收特異性差別條帶；
Ⅴ.用同一引物對(duì)擴(kuò)增已回收的DNA條帶；
Ⅵ.用Northern，Southern及測(cè)序法分析所得的條帶；
Ⅶ.以該DNA片段做探針，篩選全長cDNA或核基因。
C.cDNA差式分析法(Representational ditterence analysis)
RDA法充分發(fā)揮了PCR以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈DNA模板的特性，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴(kuò)增了目的基因片段。因?yàn)樵囼?yàn)對(duì)象（Tester）和供試探針（Driver）在接受差式分析前均經(jīng)一個(gè)4堿基切割酶處理，形成平均長度256bp的代表群（representation）保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。每次T減D反應(yīng)后僅設(shè)置72℃復(fù)性與延伸，94℃復(fù)性這兩個(gè)參數(shù)共20個(gè)PCR循環(huán)，PCR產(chǎn)物的特異性和所得探針的純度非常高。
D.酵母雙雜交體系
Two-hybrid system也叫interaction trap（相互作用陷井），是90年代初發(fā)展起來的分離基因的新方法，可用于分離能與已知靶蛋白質(zhì)（target protein）相互作用的基因。
基本原理：
真核生物的轉(zhuǎn)錄因子大多是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上分開、功能上獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成的。如GAL4的N端1-147aa是DNA結(jié)合域（BD），其C端768-881aa是轉(zhuǎn)錄激活域（AD）。一般情況下，AD能與GAL4效應(yīng)基因啟動(dòng)子上游的特定DNA區(qū)段（UAS）相結(jié)合，而此時(shí)，AD則推動(dòng)了轉(zhuǎn)錄起始。
若用基因工程的方法，將GAL4 AD和BD分別克隆到不同的載體上，導(dǎo)入同一細(xì)胞株中表達(dá)，效應(yīng)基因無法被激活,但可把來自不同轉(zhuǎn)錄因子的AD或BD區(qū)域連成一個(gè)功能基因。
主要實(shí)驗(yàn)過程：
a. 選擇缺失GAL4編碼基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c；
b. 構(gòu)建帶有GAL1 UAS-啟動(dòng)子-lac Z（His3）的轉(zhuǎn)化載體;
c. 把已知的靶蛋白質(zhì)編碼基因克隆到pGBT9的多克隆位點(diǎn)上，把所有cDNA都克隆到pGAD424載體上，構(gòu)成cDNA表達(dá)文庫。
d. 從大腸桿菌中分別提取這兩種重組質(zhì)粒DNA，共轉(zhuǎn)化感受態(tài)釀酒酵母菌株。
e. 將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培養(yǎng)基上，篩選表達(dá)相互作用的雜種蛋白的陽性菌落。
E.基因的圖位克隆法
Map-based
cloning是分離未知性狀目的基因的一種好方法。從理論上說，所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可以通過該方法克隆得到。首先，將目的基因定位到某個(gè)染色體的特定位點(diǎn)，并在其兩側(cè)確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標(biāo)記。二、利用與目的基因最緊密連鎖的一對(duì)分子標(biāo)記作探針，通過染色體步移技術(shù)將位于這兩個(gè)標(biāo)記之間的基因片段克隆并分離出來。三、根據(jù)基因功能互作原理鑒定目的基因。
通過對(duì)許多不同的生態(tài)型及大量限制性內(nèi)切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標(biāo)記。在RFLP作圖中，連鎖距離是根據(jù)重組率來計(jì)算的，1cm（厘米）相當(dāng)于1%的重組率。人類基因組中，1cm≈1000kb;擬南芥菜中，1cm≈290kb;小麥中，
1cm≈3500kb。
四、 DNA的Microarray
只要事先除去高度及中等重復(fù)序列，任何DNA都可以被用于Microarray。最簡(jiǎn)單的例子是用機(jī)械手把極微量（nanoliters）的DNA點(diǎn)到玻片或其它載體上，照射UV
light使之永久固定，用不同細(xì)胞周期發(fā)育階段的cDNA作探針系統(tǒng)性地研究細(xì)胞中任意時(shí)期特異表達(dá)的基因；若把某一生物體內(nèi)全部全部已知基因分別點(diǎn)到DNA微列陣或者基因芯片上，再用不同發(fā)育階段的cDNA與之雜交，就能了解某些基因?qū)μ囟ㄉL發(fā)育階段的重要性；基因芯片還可用于進(jìn)行基因診斷，可建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標(biāo)準(zhǔn)雜交信號(hào)圖。用可疑病人的cDNA做探針與之雜交，檢查哪些基因的表達(dá)受抑制或激活。
第六講 原核基因表達(dá)調(diào)控
原核生物和單細(xì)胞真核生物直接暴露在變幻莫測(cè)的環(huán)境中，食物供應(yīng)毫無保障，只有能根據(jù)環(huán)境條件的改變合成各種不同的蛋白質(zhì)，使代謝過程適應(yīng)環(huán)境的變化，才能維持自身的生存和繁衍。自然選擇傾向于保留高效率的生命過程。在一個(gè)每30min增殖一倍的109細(xì)菌群體中，若有一個(gè)細(xì)菌變成了29.5min增殖一倍，大約經(jīng)過80天的連續(xù)生長后，這個(gè)群體中的99.9%都將具有29.5min增殖一倍的生長速度。
一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中約有2500-3000個(gè)基因。估計(jì)正常情況下，可帶有107個(gè)蛋白質(zhì)，平均每個(gè)基因產(chǎn)生3000多個(gè)蛋白質(zhì)分子。但大腸桿菌中一般帶有15,000-30,000個(gè)核糖體，有50余種核糖體結(jié)合蛋白，數(shù)量也很驚人。此外，負(fù)責(zé)糖酵解系統(tǒng)的蛋白質(zhì)數(shù)量也很大。而象半乳糖苷酶等誘導(dǎo)酶，其含量可少至每細(xì)胞僅1-5個(gè)分子。
一個(gè)體系在需要時(shí)被打開，不需要時(shí)被關(guān)閉。這種"開-關(guān)"（on-off）活性是通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄來建立的，也就是說mRNA的合成是可以被調(diào)節(jié)的。當(dāng)我們說一個(gè)系統(tǒng)處于"off"狀態(tài)時(shí)，也有本底水平的基因表達(dá)，常常是每世代每個(gè)細(xì)胞只合成1或2個(gè)mRNA分子。所謂"關(guān)"實(shí)際的意思是基因表達(dá)量特別低，很難甚至無法檢測(cè)。
科學(xué)家把這個(gè)從DNA到蛋白質(zhì)的過程稱為基因表達(dá)(gene expression)，對(duì)這個(gè)過程的調(diào)節(jié)就稱為基因表達(dá)調(diào)控(gene regulation或gene control)。要了解動(dòng)、植物生長發(fā)育的規(guī)律、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能，就必須弄清楚基因表達(dá)調(diào)控的時(shí)間和空間概念，掌握了基因表達(dá)調(diào)控的秘密，我們手中就有了一把揭示生物學(xué)奧妙的金鑰匙。
基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：
① 轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控(transcriptional regulation)；
② mRNA加工成熟水平上的調(diào)控(differential processing of RNA transcript)；
③ 翻譯水平上的調(diào)控(differential translation of mRNA).
原核生物中，營養(yǎng)狀況(nutritionalstatus)和環(huán)境因素(environmental factor)對(duì)基因表達(dá)起著舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormone level)和發(fā)育階段(developmental stage)是基因表達(dá)調(diào)控的最主要手段，營養(yǎng)和環(huán)境因素的影響力大為下降。
一、 乳糖操縱子的調(diào)控模式
大腸桿菌乳糖操縱子(lactose
operon)包括3個(gè)結(jié)構(gòu)基因：Z、Y和A，以及啟動(dòng)子、控制子和阻遏子等。轉(zhuǎn)錄時(shí)，RNA聚合酶首先與啟動(dòng)區(qū)(promoter,P)結(jié)合，通過操縱區(qū)(operator,O)向右轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄從O區(qū)的中間開始，按Z→Y→A方向進(jìn)行，每次轉(zhuǎn)錄出來的一條mRNA上都帶有這3個(gè)基因。轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是啟動(dòng)區(qū)和操縱區(qū)進(jìn)行的。
Z編碼β-半乳糖苷酶；Y編碼β-半乳糖苷透過酶；A編碼β-半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶。β-半乳糖苷酶是一種β-半乳糖苷鍵的專一性酶，除能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，還能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。β-半乳糖苷透過酶的作用是使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透過大腸桿菌細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。β-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶的作用是把乙酰輔酶A上的乙?；D(zhuǎn)到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。
1． 酶的誘導(dǎo)-lac體系受調(diào)控的證據(jù)
在不含乳糖及β-半乳糖苷的培養(yǎng)基中，lac+基因型每個(gè)大腸桿功細(xì)胞內(nèi)大約只有1-2個(gè)酶分子。如果在培養(yǎng)基中加入乳糖，酶的濃度很快達(dá)到細(xì)胞總蛋白量的6%或7%，每個(gè)細(xì)胞中可有超過105個(gè)酶分子。
科學(xué)家把大腸桿菌細(xì)胞放在加有放射性35S標(biāo)記的氨基酸但沒有任何半乳糖誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中繁殖幾代，然后再將這些帶有放射活性的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到不含35S、無放射性的培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)基中誘導(dǎo)物的加入，β-半乳糖苷酶便開始合成。分離β-半乳糖苷酶，發(fā)現(xiàn)這種酶無35S標(biāo)記。說明酶的合成不是由前體轉(zhuǎn)化而來的，而是加入誘導(dǎo)物后新合成的。
已經(jīng)分離在有誘導(dǎo)物或沒有誘導(dǎo)物的情況下都能產(chǎn)生lacmRNA的突變體，這種失去調(diào)節(jié)能力的突變體稱為永久型突變體，為分兩類：I型和O型。
I型：野生型為I+，突變型為I-
O型：野生型為O+，突變型為Oc。
I+→I-或O+→Oc后，Z、Y、A結(jié)構(gòu)基因均表現(xiàn)為永久表達(dá)，所以I基因被稱為調(diào)節(jié)基因(regulatory gene)。研究發(fā)現(xiàn)，I基因是一個(gè)產(chǎn)生阻遏物的調(diào)節(jié)基因，其產(chǎn)物使體系關(guān)閉。I-突變體由于不能產(chǎn)生阻遏物，使細(xì)胞成為lac永久表達(dá)型。I-/I+局部二倍體由于帶有一個(gè)正常阻遏物，使細(xì)胞中的lac仍然被抑制。
遺傳學(xué)圖譜分析指出，Oc突變位于I與Z之間，所以，lac體系的4個(gè)基因的序列為IOZY。通過這些觀察，Jacob和Monod推斷Oc突變代表DNA鏈上的一個(gè)位點(diǎn)或一個(gè)非編碼區(qū)域，而不是一個(gè)基因，因?yàn)榭删幋a的基因具有互補(bǔ)性，而Oc沒有這一特性。O決定相鄰Z基因的產(chǎn)物是誘導(dǎo)型合成還是永久型合成，O區(qū)域稱為操縱基因。
2. 操縱子模型
Jacob和Monod認(rèn)為誘導(dǎo)酶（他們當(dāng)時(shí)稱為適應(yīng)酶）現(xiàn)象是個(gè)基因調(diào)控問題，可以用實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究，因此選為突破口，終于通過大量實(shí)驗(yàn)及分析，建立了該操縱子的控制模型。
① Z、Y、A基因的產(chǎn)物由同一條多順反子的mRNA分子所編碼。
② 這個(gè)mRNA分子的啟動(dòng)子緊接著O區(qū)，而位于I與O之間的啟動(dòng)子區(qū)（P），不能單獨(dú)起動(dòng)合成β-半乳糖苷酶和透過酶的生理過程。
③ 操縱基因是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結(jié)合位點(diǎn)。
④當(dāng)阻遏物與操縱基因結(jié)合時(shí)，lacmRNA的轉(zhuǎn)錄起始受到抑制。
⑤誘導(dǎo)物通過與阻遏物結(jié)合，改變它的三維構(gòu)象，使之不能與操縱基因結(jié)合，從而激發(fā)lacmRNA的合成。當(dāng)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，操縱基因區(qū)沒有被阻遏物占據(jù)，所以啟動(dòng)子能夠順利起始mRNA的合成。
3. Lac操縱子的本底水平表達(dá)
因?yàn)檎T導(dǎo)物需要穿過細(xì)胞膜才能與阻遏物結(jié)合，而運(yùn)轉(zhuǎn)誘導(dǎo)物需要透過酶。在非誘導(dǎo)狀態(tài)下有少量（1-5個(gè)mRNA分子）lac mRNA合成--本底水平永久型合成。
4. 葡萄糖對(duì)lac操縱子的影響--代謝物阻遏效應(yīng)
研究表明，葡萄糖對(duì)lac操縱子表達(dá)的抑制作用是間接的，因?yàn)榇嬖谝环N大腸桿菌突變株，它正常的糖酵解過程受阻，葡萄糖-6-磷酸不能轉(zhuǎn)化為下一步代謝中間物，該菌株能在有葡萄糖存在的情況下被誘導(dǎo)合成lac mRNA。
5. cAMP與代謝物激活蛋白
當(dāng)葡萄糖和乳糖同時(shí)存在于培養(yǎng)基中時(shí)，lac啟動(dòng)子表達(dá)受阻，沒有β-半乳糖苷酶活性；當(dāng)葡萄糖消耗完以后（圖中箭頭處），細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加，β-半乳糖苷酶活性被誘導(dǎo)，一度停止生長的細(xì)胞又恢復(fù)分裂。如果將細(xì)菌放在缺乏碳源的培養(yǎng)基中，細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度就很高；若在含葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)菌中的cAMP濃度就會(huì)很低；如果將細(xì)菌置于甘油或乳糖等不進(jìn)行糖酵解的碳源培養(yǎng)基中，細(xì)菌中cAMP的濃度也會(huì)很高。
研究證實(shí)，葡萄糖所引起的代謝物抑制(Catabolite repression)現(xiàn)象的實(shí)質(zhì)是該代謝物降低了細(xì)胞中cAMP的含量.事實(shí)上，cAMP-CAP復(fù)合物是lac體系的positive regulator，它們不能代替lacI和lacO的功能(negative regulator)。
cAMP-CAP不但能與DNA相結(jié)合，造成雙螺旋彎曲，易于形成三元轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，它還能直接影響RNA聚合酶的活性。Dominant negative（Trans-dominant）lacI-d，只要有這個(gè)"環(huán)"的亞基存在，lacI+基因產(chǎn)物（阻遏物）無法與O區(qū)相結(jié)合lac operon得到表達(dá)。
6. lac操縱子DNA的調(diào)控區(qū)域--P.O.區(qū)
lac
P（啟動(dòng)子區(qū)）從I基因結(jié)束到mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)止，共長82bp（-82～+1）O區(qū)就是阻遏物結(jié)合區(qū)，位于P區(qū)后半部分和轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（-7～+28），該區(qū)序列有對(duì)稱性，其對(duì)稱中心點(diǎn)在+11位。P區(qū)的CAMP-CAP結(jié)合區(qū)（-67～-52）也有對(duì)稱性，其對(duì)稱位點(diǎn)在-60～-59之間。
在一個(gè)完全被誘導(dǎo)的細(xì)胞中，β-半乳糖苷酶、透過酶及乙酰基轉(zhuǎn)移酶的拷貝數(shù)比例為1:0.5:0.2，這個(gè)比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作為唯一碳源時(shí)細(xì)胞的需要。不同的酶在數(shù)量上的差異是由于在翻譯水平上受到調(diào)節(jié)所致。
①lac mRNA可能與翻譯過程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質(zhì)鏈的翻譯。這種現(xiàn)象發(fā)生的頻率取決于每一個(gè)后續(xù)的AUG密碼子再度起始翻譯的概率。
②在lac mRNA分子內(nèi)部，A基因比Z基因?
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