檢測不同樣品中三聚氰胺的含量實驗
簡介：
SPECTRAMAX APPLICATION NOTE #13使用 Molecular Devices公司的SpectraMax光吸收型讀板機及羅默實驗室AgraQuant三聚氰胺檢測試劑盒可快速檢測不同樣品中三聚氰胺的含量有機堿三聚氰胺可用于生產(chǎn)很多產(chǎn)品，如塑料、阻燃材料、顏料和肥料等。最近有報道稱某些廠家在動物飼料和人類的食品中添加三聚氰胺用于增加其中蛋白質(zhì)的含量。由于三聚氰胺潛在毒性可引起人和動物的一系列疾病，甚至死亡。所以在各種食品中檢測三聚氰胺含量方法越來越受到大家重視。在此篇應用文章中介紹并驗證了兩種來自于羅默實驗室的三聚氰胺ELISA檢測試劑盒：AgraQuant三聚氰胺檢測試劑盒和AgraQuant靈敏型三聚氰胺檢測試劑盒。
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AgraQuant三聚氰胺檢測試劑盒采用的原理為直接競爭酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，主要用于麥麩和寵物食品中的三聚氰胺含量的檢測。AgraQuant靈敏型三聚氰胺檢測試劑盒適合于對靈敏度要求更高的ELISA實驗，如對牛奶、奶粉和其它日常消費品中三聚氰胺的檢測。兩種試劑盒，都是將待檢測的樣品和酶標記三聚氰胺加入預先包被有三聚氰胺抗體的微孔板中，待檢測樣品和標準品與酶標記三聚氰胺相互競爭的與微孔板中已包被的抗體結(jié)合。孵育一段時間后，使用緩沖液清洗微孔板，隨后加入底物后再孵育一段時間后顯色。在第二次孵育后，加入反應終止液來終止反應，在酶標儀中檢測其在450nm波長下的吸光度值。顏色深度與混合物中樣品及標準品中三聚氰胺的含量成反比。樣品中三聚氰胺的含量可由標準曲線擬合后算出。
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Molecular Devices光吸收型讀板機檢測三聚氰胺的吸光度值，針對三聚氰胺ELISA檢測使用SoftMax? Pro GxP 軟件中預先內(nèi)置的模板進行數(shù)據(jù)的收集和分析，此軟件是工業(yè)標準的分析軟件， 具有美國FDA21 CFR Part11認證。
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材料：
方法：
針對兩個檢測試劑盒，都遵循以下檢測步驟：
Molecular Devices具有吸收光檢測模式的微孔板讀板機，包括：
° SpectraMax? Plus384 (Cat. #PLUS 384)
° SpectraMax 190 (Cat. #190)
° SpectraMax 340PC384 (Cat. #340PC 384)
° VersaMax? (Cat. #VERSAMAX)
° VMax? (Cat. #VMAX)
° EMax? (Cat. #EMAX)
° SpectraMax M2/M2e (Cat. # M2 or M2E)
° SpectraMax M5/M5e (Cat. #M5 or M5E)
° FlexStation? 3 (Cat. #FLEX3)
AgraQuant Melamine Test Kit (Romer Labs Cat. #COKAQ9300)
AgraQuant Melamine Sensitive Test Kit(Romer Labs Cat. #COKAQ9400)
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·?使用以前先將試劑放在室溫環(huán)境下一段時間后再使用。
·?將檢測板條放入板框適配器中，不使用的微孔板條放在具有干燥劑的塑料袋中。
·?使用單道槍將150ul三聚氰胺標準品加入檢測孔中，每次分裝后均換槍頭，三聚氰胺檢測試劑盒包含0, 2 0 , 1 0 0和500ppb標準品，靈敏型三聚氰胺檢測試劑盒包含0,20,100和1000ppb標準品。
·??使用8道排槍將50ul酶標記三聚氰胺分裝入微孔板中。
·??將微孔板均勻震蕩60秒后在室溫條件下孵育30分鐘。
·??將孔內(nèi)的液體吸干后加入400ul去離子水后清洗4遍。
·??清洗后將微孔板倒扣在吸水紙表面，以便于去除殘余洗液。
·??使用排槍將100ul底物溶液加入孔中。
·??將微孔板放在室溫條件下孵育20分鐘。
·??使用排槍將100ul終止反應液加入孔中。
·??使用VersaMax微孔板讀板機，選擇SoftMax Pro軟件內(nèi)預置的模板檢測其在450nm波長下的光吸收值。
·?? SoftMax Pro軟件中選擇Semi-log曲線擬合方式。
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結(jié)果：
各標品的OD值與零標準品OD值的比值(B/Bo)構(gòu)建一條Semi-log方式擬合的濃度效應學曲線。根據(jù)擬合生成的標準曲線可計算出樣品中三聚氰胺的濃度。
如果樣品中三聚氰胺的含量高于500ppb(常規(guī)試劑盒)或者1000ppb(靈敏型試劑盒)，樣品需要進一步的進行稀釋后重新分析以便獲得精確的檢測結(jié)果。如果樣品中三聚氰胺的含量低于20ppb,結(jié)果中就會自動生成報告顯示為“< (20 x dilution factor) ppb” (1,2)。
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圖一為三聚氰胺檢測試劑盒標準曲線logit(B/ Bo) vs. log(concentration)，B為每個標準品的平均吸光度值，Bo為0ppb標準品的平均吸光度值。圖二為靈敏型三聚氰胺檢測試劑盒的標準曲線，每條標準曲線的r2值均為0.999，羅默實驗室推薦的r2值應不低于0.985(常規(guī)試劑盒)和0.990(靈敏型試劑盒)。通過標準曲線計算出50%抑制率的濃度124.2ppb(常規(guī)試劑盒)和77.4ppb(靈敏型試劑盒)；兩個數(shù)值與試劑盒說明書中給出的值相一致。
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根據(jù)三聚氰胺檢測試劑盒和靈敏型三聚氰胺檢測試劑盒的要求得出重復性高的數(shù)據(jù)，標準曲線的變異系數(shù)值(CVs)<9%。這篇應用文章中所有標準曲線的CVs≤5%(見表一和表二)。
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通過SoftMax Pro軟件計算出平均OD值，標準偏差值，平均B/Bo值和CVs值。實際檢測后的變異系數(shù)值(CVs≤5%)優(yōu)于羅默實驗室試劑盒說明書給出的值(CVs<9%)。
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結(jié)論：
羅默公司的三聚氰胺檢測試劑盒和靈敏型三聚氰胺檢測試劑盒在結(jié)合Molecular Devices公司推出的SpectraMax, Versa-Max, VMax, and EMax微孔板讀板機，可以針對各種奶制品如鮮奶、奶粉、酸奶）和面粉及各種寵物食品中三聚氰胺的含量獲得更加準確的檢測結(jié)果。最后通過SoftMaxPro GxP軟件獲得全部數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，此款為工業(yè)標準分析軟件并且符合FDA 21 CFR Part 11要求。
Molecular Devices公司的AquaMax? 4000微孔板洗板機連接其StakMax堆板機可以使得ELI S A檢測全自動化，增加檢測通量。用戶也可以將S t a k M a x ?堆板機與Molecular Devices公司SpectraMax或VersaMax微孔板讀板機連接。減少手動操作實現(xiàn)最高通量的檢測。
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參考文獻：
1. AgraQuant Melamine Test Kit product insert and Certificate of Performance.
2. AgraQuant Melamine Sensitive Test Kit product insert and Certificate of Performance.
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