藥物旋光度測(cè)定
光是一種電磁波，光波的振動(dòng)方向與光的前進(jìn)方向垂直。如果讓光通過(guò)一個(gè)像柵欄一樣的尼科爾棱鏡(起偏鏡)就不是所有方向的光都能通過(guò)，而只有與棱鏡晶軸方向平行的光才能通過(guò)。這樣，透過(guò)棱晶的光就只能在一個(gè)方向上振動(dòng)，像這種只在一個(gè)平面振動(dòng)的光稱為平面偏振光，簡(jiǎn)稱偏振光或偏光。
很多藥物具有光學(xué)活性，能使入射的平面偏振光旋轉(zhuǎn)，即射出的光線與入射的光線可形成一定的可測(cè)量的角度。某些晶體以及很多藥用液體或固體的溶液都具有這種特性。當(dāng)某種液體或溶液中的溶質(zhì)具有該特性時(shí)，一般是由于其結(jié)構(gòu)中具有1個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中心所致，通常是具有4個(gè)不同取代基的碳原子。光學(xué)異構(gòu)體的數(shù)量為2n，此處n為不對(duì)稱中心的數(shù)量。旋光測(cè)定法即測(cè)定藥物的旋光度，也許是區(qū)分光學(xué)異構(gòu)體的唯一簡(jiǎn)便的方法。因此，該方法是鑒別和純度檢查的一項(xiàng)重要指標(biāo)。
許多有機(jī)化合物為手性物質(zhì)，具有光學(xué)活性，即平面偏振光通過(guò)其液體或溶液時(shí)能引起旋光現(xiàn)象，使偏振光的平面向左或向右發(fā)生旋轉(zhuǎn)，偏轉(zhuǎn)的度數(shù)稱為旋光度。這種特性是由于物質(zhì)分子中含有不對(duì)稱元素(通常為不對(duì)稱碳原子)所致。使偏振光向右旋轉(zhuǎn)者(順時(shí)針?lè)较?，朝光源觀測(cè))稱為右旋物質(zhì)，常以“十”號(hào)表示；使偏振光向左旋轉(zhuǎn)者則稱為左旋物質(zhì)，常以“一”號(hào)表示(以前曾用符號(hào)d-和l-來(lái)分別表示右旋和左旋異構(gòu)體，因容易與D-和L-混淆，目前已不再使用，而D-和L-只表示涉及與D-甘油醛相關(guān)的構(gòu)型。符號(hào)R和S以及a和β也用來(lái)表征構(gòu)型，即原子或原子組團(tuán)在空間的排列)。影響物質(zhì)旋光度的因素很多，除化合物的特性外，還與測(cè)定波長(zhǎng)、偏振光通過(guò)的供試液濃度與液層的厚度以及測(cè)定時(shí)的溫度有關(guān)。當(dāng)偏振光通過(guò)長(zhǎng)1dm、每1 ml中含有旋光性物質(zhì)1g的溶液，測(cè)定的旋光度稱為該物質(zhì)的比旋度，以[a]tλ表示。t為測(cè)定時(shí)的溫度，A為測(cè)定波長(zhǎng)。通常測(cè)定溫度為20℃，使用鈉光譜的D線(589.3nm)，表示為[a]D20。
比旋度為物質(zhì)的物理常數(shù)，可用以檢查某些物質(zhì)的光學(xué)活性和純雜程度。旋光度在一定條件下與濃度呈線性關(guān)系，故還可以用來(lái)測(cè)定含量。
一、旋光儀的基本結(jié)構(gòu)
旋光儀又稱旋光計(jì)，是藥品檢驗(yàn)工作中較早使用的儀器。歷史上，旋光度測(cè)定法是用一種靠肉眼評(píng)估分離區(qū)域強(qiáng)度以測(cè)量旋光度值的儀器來(lái)進(jìn)行的。因此，最常用的是鈉燈在可見(jiàn)光區(qū)的D線(589nm)。在D線測(cè)定的比旋度用以下符號(hào)表示：[a]D25或[a]D20。
許多數(shù)據(jù)都是用這種形式表示的。因此，早期的圓盤式旋光儀由鈉光燈光源、起偏鏡、測(cè)定管、檢偏鏡、半影板調(diào)零裝置和支架組成(圖10-3)。起偏鏡是一組可以產(chǎn)生平面偏振光的晶體，稱為尼科爾棱鏡，用一種天然晶體如方解石按一定方法切割再用樹(shù)膠黏合而制成。現(xiàn)今則多采用在塑料膜上涂上某些具有光學(xué)活性的物質(zhì)，使其產(chǎn)生偏振光。早期旋光儀用人眼觀測(cè)誤差較大，讀數(shù)精度為0.05o。20世紀(jì)80年代數(shù)顯自動(dòng)指示旋光儀和投影自動(dòng)指示旋光儀相繼出現(xiàn)，儀器的讀數(shù)精度也分別提高到了0.01o和0.005o《中國(guó)藥典》2015年版四部規(guī)定使用讀數(shù)精度達(dá)到0.01o的旋光儀。
圖10-3 常用旋光儀的基本結(jié)構(gòu)圖
1．光源；2．過(guò)濾器；3.起偏器；4．樣品管；5．檢偏器；6．過(guò)濾器；7．檢測(cè)器
光源除使用鈉光燈外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用較短的波長(zhǎng)，如光電偏振計(jì)使用濾光片得到汞燈波長(zhǎng)約為578、546、436、405和365nm處的最大透射率的單色光，能得到更高的靈敏度，從而可降低被測(cè)化合物的濃度。一般而言，與在589nm處測(cè)得的旋光度值相比，436nm處的測(cè)定值是其2倍，而365nm處的測(cè)定值是其3倍。有時(shí)可通過(guò)將被測(cè)物轉(zhuǎn)換成旋光度顯著較高的其他形式，來(lái)降低測(cè)量所需的溶液濃度。測(cè)量所用的溶劑也會(huì)影響旋光度值，故常明確規(guī)定溶劑。
圖10-4 鹵鎢燈源旋光儀結(jié)構(gòu)示意圖
1．鹵素?zé)簦?．垂直透鏡；3．起偏鏡；4．法拉第調(diào)節(jié)器；5．旋光管(樣品)；6．旋轉(zhuǎn)分析器(檢偏器); 7．光電角碼譯器；8.干涉濾光片；9．光接收器
現(xiàn)今也廣泛運(yùn)用一些其他光源，如帶有適當(dāng)濾光器的氙燈或鹵鎢燈(圖10-4)，與傳統(tǒng)光源相比，新的光源具有在成本、使用壽命、廣譜發(fā)射波長(zhǎng)等方面的優(yōu)勢(shì)。
二、操作方法
(一)比旋度的測(cè)定
1．開(kāi)啟旋光儀鈉光燈啟動(dòng)后至少20分鐘后發(fā)光才能穩(wěn)定，測(cè)定或讀數(shù)時(shí)應(yīng)在鈉光燈穩(wěn)定后讀取。其他光源如汞燈、氙燈、鎢燈等，可按使用說(shuō)明書進(jìn)行操作。
2．空白測(cè)定純液體樣品測(cè)定時(shí)以干燥的空白測(cè)定管校正儀器零點(diǎn)，溶液樣品則用空白溶劑校正儀器零點(diǎn)。每次測(cè)定前應(yīng)以溶劑作空白校正，測(cè)定后，再校正1次，以確定在測(cè)定時(shí)零點(diǎn)有無(wú)變動(dòng)；如第2次測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)零點(diǎn)有變動(dòng)，則應(yīng)重新測(cè)定旋光度。
3．旋光度測(cè)定測(cè)定旋光度時(shí)，用供試液體或溶液(按各品種項(xiàng)下的規(guī)定制備)將測(cè)定管沖洗數(shù)次，緩緩注人供試液體或溶液適量，注意勿使發(fā)生氣泡，如有氣泡，應(yīng)使其浮于測(cè)定管凸頸處；旋緊測(cè)試管螺帽，兩端的玻璃窗用濾紙與鏡頭紙擦拭于凈。將旋光管置于旋光計(jì)內(nèi)檢測(cè)讀數(shù)，即得供試液的旋光度口使偏振光向右旋轉(zhuǎn)者(順時(shí)針?lè)较?為右旋，以“＋”符號(hào)表示；使偏振光向左旋轉(zhuǎn)者(反時(shí)針?lè)较?為左旋，以“一”符號(hào)表示。供試液與空白溶劑用同一測(cè)定管，每次測(cè)定應(yīng)保持測(cè)定管方向、位置不變。旋光度讀數(shù)應(yīng)重復(fù)3次，取其平均值，按下列公式計(jì)算比旋度。
式中，λ為使用光源的波長(zhǎng)，如使用鈉光燈的D線可用D代替；t為測(cè)定溫度，℃;l為測(cè)定管的長(zhǎng)度，dm;a為測(cè)得的旋光度；d為液體的相對(duì)密度；c為每100m1溶液中含有被測(cè)物質(zhì)的重量，g(按干燥品或無(wú)水物計(jì)算)。
(二)含量的測(cè)定
按各品種項(xiàng)下的規(guī)定進(jìn)行操作，配制2份供試品溶液做平行試驗(yàn)，供試品溶液的濃度應(yīng)盡量與要求的一致，其他同“比旋度的測(cè)定”。2份結(jié)果的相對(duì)偏差應(yīng)在1％以內(nèi)。
三、應(yīng)用范圍
手性物質(zhì)使平面偏振光產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)的角度與其手性異構(gòu)體相同但方向相反，除上述特性以及與其他手性物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)的區(qū)別以外，手性異構(gòu)體的物理化學(xué)屬性完全相同。因生物受體和酶本身都是手性的，對(duì)映體通常在藥理與毒理方面有著很大的差異。很多來(lái)源于自然界的物質(zhì)，例如氨基酸、蛋白質(zhì)、生物堿、抗體、糖苷、糖等，均以手性化合物的形式存在。使用非手性物質(zhì)合成此類化合物導(dǎo)致等量的對(duì)映異構(gòu)體，即外消旋體。外消旋體的旋光度凈值為零，其物理性質(zhì)也可能與組成其的對(duì)映體不同。
1．用于手性物質(zhì)及外消旋體的鑒別。
2．用于手性化合物的純度檢查。
3．用于旋光物質(zhì)(如葡萄糖)的含量測(cè)定。
