熒光定量PCR擴增曲線形狀異常的原因
A.擴增效率過高
? ? 出現(xiàn)非特異擴增或引物二聚體：反應(yīng)體系內(nèi)模板濃度太高以及模板核酸質(zhì)量較差，可能導(dǎo)致出現(xiàn)抑制PCR反應(yīng)的現(xiàn)象。在絕對定量時表現(xiàn)擴增效率大于110%。
? ? 解決方案：去除模板濃度最高的反應(yīng)孔并重新分析標(biāo)準(zhǔn)曲線；對目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，一般用質(zhì)粒做梯度稀釋，或用PCR產(chǎn)物做梯度稀釋，然后做定量擴增，通過曲線評估反應(yīng)效率。絕對定量有效的擴增效率在 90%-110%；重新純化模板，去除模板中存在的潛在抑制物。
? ? B.擴增效率過低
? ? 擴增效率過低主要表現(xiàn)在試劑濃度不適（主要是引物、鎂和Taq DNA聚合酶，尤其是在多重實驗中），引物對Tm之間的差異超過5°C以及熱循環(huán)條件不適，試管中各種同源物質(zhì)的競爭作用可造成反應(yīng)效率低下。絕對定量表現(xiàn)：擴增效率＜90%。
? ? 解決方案：對上述因素逐一排除后進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化實驗體系或選用Biog、ABI等質(zhì)量比較穩(wěn)定的試劑盒。
? ? C.個別擴增曲線異常
? ? 如個別擴增曲線突然驟降：反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡，由于溫度升高后氣泡破裂，使儀器檢測到的熒光值突然降低所致。進(jìn)行擴增反應(yīng)之前要仔細(xì)檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡殘留。
? ? 儀器設(shè)置不當(dāng)引起的曲線異常：基線設(shè)置不當(dāng)，如擴增曲線斷裂或下滑：基線的終點值大于Ct值。減小基線終點 (Ct 值- 4)，重新分析數(shù)據(jù)。
? ? Rox添加不當(dāng)：表現(xiàn)為擴增曲線呈鋸齒狀且不連續(xù)，需校正參比染料。
