本實(shí)驗(yàn)介紹關(guān)于通過重疊延伸和基因 SOEing 進(jìn)行 PCR 突變的過程。本實(shí)驗(yàn)來源于 PCR 實(shí)驗(yàn)指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。
| 試劑、試劑盒 | 無菌 H2OPCR 緩沖液限制性酶和緩沖液Taq DNA 聚合酶PCR 模板5'和 3'引物dNTP |
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| 儀器、耗材 | DNA 測(cè)序裝置熱循環(huán)儀瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備 |
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| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
無菌 H2O
2. 酶和酶緩沖液
10XPCR 緩沖液（Roche)，包含 100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/L，KCl 和 15 mml/LMgCl2
限制性酶和緩沖液
Taq DNA 聚合酶（Roche)
3. 核酸和寡核苷酸
10X dNTP, 商品出售的 dNTP 溶液（AmershamBiosciences) 是 100umol/L 濃度的儲(chǔ)存液，可以用無菌水稀釋。
PCR 模板
5'和 3'引物
4. 特殊設(shè)備
DNA 測(cè)序裝置
熱循環(huán)儀
5. 其他
瓊脂糖，分離 DNA 片段所需的瓊脂糖濃度依賴于需要分離的片段的大小。依經(jīng)驗(yàn)，0.8%~1% 的 SeaKem GTG 瓊脂糖（Cambrex)(用 1XTAE 配制）一般都能夠令人滿意地分離 0.25~2kb 大小的 DNA 片段。
瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備
GENECLEANⅡ試劑盒（BIO101)
6. 載體和菌株
PCR 產(chǎn)物測(cè)序所需的克隆載體和菌株。
二、方法
1. 通過重疊延伸進(jìn)行 PCR 突變
（1）在獨(dú)立的微量離心管中進(jìn)行 PCR 反應(yīng)生成產(chǎn)物 AB 和 CD(參見圖 32-1)。這些反應(yīng)混合物能夠在室溫下混合。
（2）反應(yīng)進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)（94℃ 1min, 50℃ 1min, 72℃ 2 min)。
（3）將每個(gè)反應(yīng)的所有反應(yīng)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
（4）切下目標(biāo)條帶（即產(chǎn)物 AB 和 CD)，用 GENECLEANUⅡ試劑盒回收 DNA 片段。
（5）在一個(gè)新的微量離心管中進(jìn)行重疊延伸反應(yīng)。
這一反應(yīng)對(duì)于加入的模扳量不十分敏感。通常每種模板可以使用 10~100ng。引物 a 和 d 也可以在PCR 反應(yīng)的開始就加入。
（6）參照上面的步驟 2 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。
（7）將反應(yīng)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下目標(biāo)條帶（即產(chǎn)物 AD)，參照步驟 4 回收 DNA片段。
（8）純化的突變產(chǎn)物 AD 隨后可以被適當(dāng)?shù)南拗菩悦杆?，然后連接到一個(gè)合適的克隆載體上進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)化和測(cè)序。
2. 基因 SOEing
（1）在獨(dú)立的微量離心管中進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，以分別產(chǎn)生來自基因 1 的產(chǎn)物 WX 和來自基因 2 的產(chǎn)物 YZ(圖 32-2)。
（2）反應(yīng)進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)（94℃ 1min, 50℃?1min，72℃ 2min)。
（3）將每個(gè)反應(yīng)的所有反應(yīng)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
（4）切下目標(biāo)條帶（即產(chǎn)物 WX 和 YZ), 用 GENECLEANB 試劑盒回收 DNA 片段。
（5）在一個(gè)微量離心管中進(jìn)行 SOEing 反應(yīng)。
（6）參照上面的步驟 2 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。
（7）將反應(yīng)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下目標(biāo)條帶（即產(chǎn)物 WZ), 參照步驟 4 回收 DNA 片段。
（8）純化的突變產(chǎn)物 WZ 隨后可以被適當(dāng)?shù)南拗菩悦杆?，然后連接到一個(gè)合適的克隆載體上進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)化和測(cè)序。 展開? |
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