篩選質(zhì)粒載體構(gòu)建表達文庫實驗
試劑、試劑盒 封閉緩沖液氯仿裂解緩沖液檢測抗原-抗體復合物所用試劑SMTNT 緩沖液洗滌緩沖液 125I 標記的蛋白質(zhì) A 或 125I 標記的免疫球蛋白放射性碘化第二抗體第一抗體LB 或 SOB 瓊脂平板
儀器、耗材 空氣培養(yǎng)箱平頭鑷子 裝有防水黑墨水（印度墨水）并帶有 18 號針頭的注射器硝酸纖維素濾膜塑料盒和玻璃陪氏大平皿Whatman3 MM 濾紙 質(zhì)粒表達文庫
實驗步驟
材料
緩沖液及溶液
貯存液，緩沖液及試劑的組分請見附錄 1。將貯存液稀釋至合適濃度。
封閉緩沖液：
10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0)
150 mmol/LNaCl
0.05%(V/V)Tween-20
20%(V/V) 胎牛血淸
其他備選封閉液如 5%(m/V) 脫脂奶粉或含 1%(m/V) 明膠和 3%(m/V) 牛血清白蛋白的 TNT緩沖液。各種試劑的優(yōu)點，不同實驗室各執(zhí)一辭。建議研究者進行預實驗以確定哪種與篩選用第一和第二抗體合用效果最好。封閉緩沖液在 4°C 保存，可重復數(shù)次使用。應加入終濃度為 0.05%（m/V)的疊氮化鈉阻抑微生物的生長。
氯仿
裂解緩沖液：
100 mmol/LTris-Cl(pH7,8}
150 mmol/LMgCl2
1.5%(m/V) 牛血清白蛋白
1ug/ml 胰 DNA 酶Ⅰ
40ug/ml 溶菌酶
檢測抗原-抗體復合物所用試劑：
利用堿性磷酸酶（AP)-偶聯(lián)抗體進行生色反應篩選所用試劑
利用辣根過氧化物酶（HRP)-偶聯(lián)抗體進行生色反應篩選所用試劑
利用化學發(fā)光反應篩選試劑
每種篩選方法所用的試劑，參見步驟 19, 關(guān)于檢測抗體的常用方法，參見本章末信息欄中利用抗體進行免疫篩選相關(guān)內(nèi)容，詳情請見附錄 9。
SM
室溫保存，用后丟棄，以防污染。
TNT 緩沖液：
10 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
150 mmol/LNaCl
0.05%(V/V)Tween-20
毎篩選 10 張濾膜需大約 1 升 TNT 緩沖液。室溫保存。
洗滌緩沖液：
含 0.1%(m/V) 牛血清白蛋白的 TNT 緩沖液
含 0.1%(m/V) 牛血清白蛋白質(zhì)和 0.1%(V/V)NP-40 的 TNT 緩沖液
這些溶液中不含疊氮化鈉。
放射性化合物
125I 標記的蛋白質(zhì) A 或 125I 標記的免疫球蛋白
放射性碘化第二抗體
若用步驟中放射性標記第二抗體來檢測抗原-抗體復合物時可用此種抗體。
抗體
第一抗體
對于第一、第二抗體的選擇，參見本章末信息欄利用抗體進行免疫篩選相關(guān)內(nèi)容詳情請見附錄 9。
培養(yǎng)基
LB 或 SOB 瓊脂平板
含有適用于構(gòu)建 cDNA 表達文庫系統(tǒng)或載體的抗生素。90 mm 平皿中應含 30~35 ml 瓊脂培養(yǎng)基，每 150 mm 平皿中含大約 50 ml。平板必須保持干燥，否則當硝酸纖維素濾膜移走時，頂層瓊脂糖會剝離。通常，把 2 天前鋪制的平板稍微打開蓋，放于 37°C 繼續(xù)干燥 1~2 h, 效果更好。
含 1 mmol/LIPTG 的 LB 或 SOB 瓊脂平板
若表達載體攜帶 lac 啟動子時，需要含 IPTG 的平板。關(guān)于 IPTG 誘導蛋白質(zhì)表達的相關(guān)內(nèi)容，請見第 15 章導言中關(guān)于含 IPTG 誘導型啟動子的表達載體的討論。
專用設備
30°C 與 42°C 空氣培養(yǎng)箱
若表達載體中含有λ噬菌體 PR 啟動子時需要（如 pEX 系列）；否則，培養(yǎng)箱可設 37°C。
平頭鑷子
裝有防水黑墨水（印度墨水）并帶有 18 號針頭的注射器
硝酸纖維素濾膜
適用于結(jié)合蛋白質(zhì)及免疫印記反應的濾膜有不含 Triton X-100 的硝酸纖維素濾膜（Millipore HATF 公司或相當產(chǎn)品）及硝酸纖維素衍生物如 Hybond-C extra(Amersham Pharmacia Biotech 公司），尼龍膜或帶極性尼龍膜因為背景較高及固定蛋白質(zhì)能力弱不適用于免疫篩選。
用軟鉛筆或圓珠筆在濾膜上作好記號. 用水打濕，夾于干燥 Whatman3 MM 濾紙之間. 用鋁箔將一疊濾紙包好，10psi(0.70 kg/cm2) 高壓蒸汽滅菌。
塑料盒和玻璃陪氏大平皿
一疊 Whatman3 MM 濾紙
毎張濾膜準備一張 Whatman3 MM 濾紙并略有富余。用鋁箔包好，高壓蒸汽滅菌（0.70 kg/cm2）。
載體及細菌株
質(zhì)粒表達文庫
按第 11 章所述利用合適表達載體構(gòu)建 cDNA 文庫，或從供應商處購買。
附加試劑
步驟 19 中需方案 1 中所列試劑。
方法
主板與膜的制備
1. 無菌平頭鑷子（如 Millipore 鑷子) 將滅菌硝酸纖維素濾膜放于 LB(或 SOB) 平板上，編號面朝下。然后將濾膜移走，倒轉(zhuǎn)后重新放好，編號面朝上。
2. 取少量菌液（每張 138 mm 濾膜可用小于 0.5 ml, 其中可含多達 20000 個細菌，每張 82 mm 濾膜則用小于 0.2 ml，其中可含 10000 個細菌。用滅菌彎頭玻璃棒涂布在濾膜表面，在濾膜迫緣留出 2~3 mm 寬的無菌邊界。室溫下放置平板直至所有液體均被吸收。
3. 倒置平板，培養(yǎng)（8~10 h) 直至出現(xiàn)極小的菌落（直徑 0.1 mm)。
用帶有 lac 啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化的菌落宜在 37°C 培養(yǎng)，而用帶有λ噬菌體 PR 啟動子表達載體轉(zhuǎn)化菌落應在 30°C 培養(yǎng)，以防表達融合蛋白。
復印濾膜的制備
4. 將一個編號并已滅菌的硝酸纖維素濾膜與另一個含有適當抗生素的瓊脂平板表面接觸而使之變濕，編號面向上，復印濾膜的編號應同主濾膜編號相對應。
5. 用滅菌平頭鑷子輕輕把主濾膜自第一平板上（步驟 3) 移至一疊 Whatman3 MM 濾紙上。有菌落面朝上。
6. 小心把第二張已濕的濾膜（編號面向下）放在相應編號的主濾膜上。要注意，一經(jīng)接觸就不要移動濾膜。將一張圓形 3 MM 濾紙放于濾膜上。在濾紙上再放空皿，底部相觸，用手壓平皿，使濾膜得到復印。
7. 當兩張濾膜夾在一起時，用 18 號針頭在濾膜上作出一系列有特定記號的定位孔。輕輕剝離濾膜，將復印濾膜放于濕潤用過的平板上（步驟 4), 將主濾膜放于含合適抗生素的新鮮平板上，有菌面向上。
如有需要，一張主濾膜可制備幾張復印濾膜。不過，如果主濾膜要用于制備兩張以上復印濾膜時應再溫育若干小時以使菌落再生。通常，一張主濾膜最好只制備兩張復印濾膜，以避免菌落模糊不淸而引起的種種問題。
8. 重復步驟 4~7 直至所有主濾膜被復印。
9. 按下述方法誘導克隆于帶有 lac 啟動子的質(zhì)粒中的基因表達。
a.37°C 溫育平板（主平板和復印平板）直至出現(xiàn)直徑 1~2 mm 的菌落。一般主板的菌落很快達到所需的大小。
b. 將主板冷卻至室溫，包上塑料膜，4°C 保存，直至獲得免疫篩選結(jié)果。
C. 將復印濾膜編號面向上放于含 lmmol/LIPTG 且預溫到 37°C 的新鮮平板上。繼續(xù)溫育 2~4 h
d. 為誘導帶λ噬菌體 PR 啟動子的表達載體（如 pEX 載體請見附錄 3) 進行表達合成，可把濾膜轉(zhuǎn)到預溫的平板上，于 42°C 溫育 2~4 h。
菌落免疫篩選中濾膜的處理
10. 在化學通風櫥中，用平頭鑷子從平板上取出硝酸纖維素濾膜，放置在濕潤的紙巾上。濾膜上用一塑料盒蓋好，再把一個裝有氯仿的無蓋玻璃平皿也放進塑料盒中。將濾膜上的細菌菌落于氯仿蒸氣中暴露 15 min。
11. 將一小部分濾膜放在裝有裂解液（每張 82 mm 濾膜用 6 ml, 每張 138 mm 濾膜用 12 ml) 的平皿中。所有濾膜均浸沒后，將平皿放在旋轉(zhuǎn)平臺上，緩緩搖動裂解緩沖液，室溫下菌落裂解需 12~16 h。
12. 濾膜轉(zhuǎn)到含 TNT 的陪氏平皿或玻璃托盤中，室溫溫育 30 min。
13. 換新鮮的 TNT 緩沖液，重復步驟 12。
14. 逐張把濾膜放在含 TNT 緩沖液的玻璃盤中，用 Kimwipes 紙去除濾膜表面的菌落殘跡。
表達融合蛋白克隆的檢測
重要：下列各步驟切勿使濾膜干燥，本來與濕潤濾膜非特異性可逆結(jié)合的抗體，一旦濾膜變干，就會永久留在濾膜上，另外濾膜浸人各種緩沖液和抗體溶液時要防止它們彼此相連，為此，可把濾膜分批（每批 5 張濾膜)，毎批單用一個大平皿或結(jié)晶血，這樣就可以減少彼此相連的問題。將平皿互相疊在一起放在低速轉(zhuǎn)動的平臺式搖床上。
15. 所有濾膜全部剝離并漂洗后，逐張放在新?lián)Q的 TNT 緩沖液中，全部濾膜都轉(zhuǎn)移完畢后，于室溫繼續(xù)溫和攪動緩沖液 30 min。
如有必要，濾膜此時可以從緩沖液中取出，用 Saran 包裝膜包好，于 4°C 保存 24 h。
16. 用平頭鑷子把濾膜逐張轉(zhuǎn)移至含封閉緩沖液（每張 82 mm 濾膜需 7.5 ml，每張 138 mm 濾膜需 15 ml) 的玻璃盤中，所有濾膜均浸沒后，室溫下在轉(zhuǎn)動平臺上慢慢搖動溶液 30 min。
17. 用平頭鑷子把濾膜轉(zhuǎn)移至含稀釋的第一抗體的封閉緩沖液（每張 82 mm 濾膜需 7.5 ml, 每張 138 mm 濾膜需 15 ml) 的新鮮玻璃盤中，使用產(chǎn)生背景不算很高但仍可檢測 50~100pg 變性抗原的最高抗體稀釋度。所有濾膜均浸沒后，室溫下在轉(zhuǎn)動平臺上緩慢搖動 30 min。
抗體可在 4°C 保存并可反復使用數(shù)次。溶液中加入終濃度為 0.05%(V/V) 的疊氮化鈉抑制微生物的生長。
18. 依次將濾膜放到下列每種緩沖液中洗滌 10 min, 在緩沖液之間轉(zhuǎn)移濾膜時應逐張進行，每張 82 mm 膜各需用緩沖液 7.5 ml; 每張 138 mm 膜需 15 ml。
含 0.1% 牛血清白蛋白的 TNT 緩沖液
含 0.1% 牛血清白蛋白和 0.1%NP-40(Nondidet P-40) 的 TNT 緩沖液
含 0.1% 牛血清白蛋白的 TNT 緩沖液
19. 利用所選擇的放射化學、生色反應或化學發(fā)光試劑檢測抗原抗體復合物。
放射化學篩選
每張濾膜需用大約 1uCi125I 標記的 A 蛋白或免疫球蛋白，放射性標記 A 蛋白已商品化（比活 2~100uCi/ug)。放射性碘標記的第二抗體可從供應商購得，也可按材料中信息欄 IgG 的放射性碘標記相關(guān)內(nèi)容進行制備。
a. 用封閉緩沖液稀釋放射性標記配體（每張 82 mm 濾膜需 7.5 ml, 每張 138 mm 濾膜需 15 ml)。
b. 室溫下溫育 lh, 用 TNT 緩沖液漂洗數(shù)次，按附錄 9 中所述進行放射自顯影。
繼續(xù)步驟 20。
生色反應篩選
識別第一抗體種特異性決定簇的辣根過氧化酶（HRP) 或堿性磷酸酶（AP) 偶聯(lián)的抗體可向廠商購買，并按產(chǎn)品說明書推薦的稀釋度及要求使用。一般每張 82 mm 濾膜，可將 5ul 偶聯(lián)抗血清加入 7.5ul 封閉緩沖液（無疊氮化鈉）中，要了解 HRP 或 AP 更多內(nèi)容，請見附錄 9。
聯(lián)合應用 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP) 底物及氮藍四唑（NBT) 對抗原-抗體-抗抗體-AP 復合物進行定位
a. 將濾膜放于含 AP-偶聯(lián)抗體的溶液中，于室溫下緩慢搖動 1.5~2 h。
b. 按步驟 14 洗滌濾膜。
c. 制備 BCIP(50 mg/ml 溶于 100%DMT) 和 NBT(50 mg/ml 溶于 70%DMT) 貯存液，避光保存。
d. 臨用前，制備 BCIP/NBT 顯影液：
I. 在 AP 緩沖液中加入 33ul NBT 溶液，混勻。
II. 加 16.5ul BCIP 貯存液，混勻，避光保存，lh 內(nèi)使用。
e. 用紙巾將濾膜吸干。
f. 將濾膜浸入 BCIP/NBT 顯影液（每張 82 mm 濾膜用 7.5 ml, 每張 138 mm 濾膜用15 ml), 室溫溫育數(shù)小時。
g. 蒸餾水略洗兩遍，在抗原抗體復合物處呈現(xiàn)深紫色。
繼續(xù)步驟 20。
利用 4-氯-1 萘酚對抗原-抗體-抗抗體-HRP 復合物進行定位
a. 將濾膜放入含 HRP-偶聯(lián)抗體的溶液中，于室溫下輕輕搖動 1.5~2 h。
b. 按步驟 14 洗滌濾膜。
C. 將 60 mg4-氯-1 萘酚溶于 20 ml 冰預冷的甲醇制成顯影液。用前，和 100 ml 含 60
ul30%H2O2 的 10 mmol/LTris-Cl(pH7.5)、l5Ommol/LNaCl 溶液混合。
d. 用紙巾將濾膜上的水吸干，再用 10 mmol/LTris-Cl(pH7.5),150 mmol/LNaCl溶液略洗一下。
e. 將濾膜浸入到 4-氯-1-萘酚顯影液中（每張 82 mm 濾膜需 10 ml, 每張 138 mm 濾膜
需 25 ml)，室溫溫育 15~20 min。
f. 蒸餾水洗滌兩遍，再抗原-抗體復合物處呈現(xiàn)深紫色。
生物素化的種特異性抗體及抗生物素蛋白質(zhì)偶聯(lián)的 HRP 也已商品化，應按不同廠商的使用說明書進行稀釋，如上述 HRP-偶聯(lián)抗體一樣進行免疫篩選。
繼續(xù)步驟 20。
發(fā)光篩選
化學發(fā)光反應是檢測免疫陽性噬菌斑最靈敏的方法。第二抗體一般與 AP 或 HRP 偶聯(lián)，使用 AP-偶聯(lián)的抗體時需要如 1，2-dioxetane phosphates 這樣的底物。這種底物磷酸化后在 466nm 波長處發(fā)光，HRP-偶聯(lián)的抗體可氧化底物魯米諾，后者在過氧化氫和苯酚存在下，可于 428nm 波長處發(fā)出強光。在兩種系統(tǒng)中，發(fā)出的光可用放射自顯影來捕獲。化學發(fā)光檢測快速、靈敏（1~10Pg 的抗原可被檢出），且可得到永久性的篩選濾膜記錄（X 射線膠片)。其潛在的缺點是試劑的高成本以及需要對放射自顯影片與母板進行比較才能得到陽性克隆，下面是典型方案。
a. 將濾膜放入含 AP 或 HRP 偶聯(lián)抗體的溶液中，于室溫下輕緩搖動 1.5~2 h。
b. 按步驟 18 對濾膜進行洗滌。
c. 按廠家說明書制備化學發(fā)光反應底物。
d. 將洗過的濾膜與化學發(fā)光反應底物溫育 1~5 min(按照廠家建議，確定最佳曝光時間)。
e. 將濾膜上多余液體除去，立即包在 Satan 包裝膜中，不要使濾膜干涸。
放射自顯影（請見附錄 9），一般初次曝光 1 min, 然后根據(jù)此間隔來決定合適曝光時間。
繼續(xù)步驟 20。
20. 鑒定陽性克隆的位置，或與復印濾膜比較，尋找一致信號。對于放射標記或化學發(fā)光探針，應將放于光箱的瓊脂平板與放射自顯影的結(jié)果比較。對于會在濾膜上留有可見陽性殘跡的生色試劑，繼續(xù)下列步驟。
a. 在濾膜上放置一疊 Saran 包裝膜或 Mylar 膜。
b. 在 Saran 包裝膜的表面用不同顏色的防水記號筆標記濾膜上各孔的位置，以及抗原陽性克隆的位置。Saran 包裝膜上還應作好標記，以便找到與濾膜相對應的平板。
c. 把包裝膜放在讀片光箱表面，將含有原始菌落的平板放在膜上核對。
d. 確定陽性噬斑區(qū)域，將含有假定陽性克隆的這一區(qū)域的瓊脂塊移到 1 ml 含有合適抗生素的 LB 培養(yǎng)液中。在適當溫度下培養(yǎng) 12~16 h。
e. 保存 Saran 包裝膜作為陽性噬斑定位的永久記錄。原始濾膜上的色斑會很快消退。
21. 重復鋪板和篩選過程直至得到一致的免疫陽性克隆。
22. 根據(jù)方案 1 末信息欄對免疫篩選分離的克隆進行確定中提供的方法鑒定免疫篩選分離的克隆。
