pcr反應(yīng)的一般程序與注意事項
標準的PCR反應(yīng)體系：10×擴增緩沖液
10ul
4種dNTP混合物
各200umol/L
引物
各10～100pmol
模板DNA
0.2ug
Taq
DNA聚合酶
2.5u
Mg2+
1.5mmol/L
加雙或三蒸水至
100ul
PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR
產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度.理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增.設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：①引物長度：15-30bp,常用為20bp左右.②引物擴增跨度：以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段.③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶.ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列.④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補,特別是3’端的互補,否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴增條帶.⑤引物3’端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個堿基,應(yīng)嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗.⑥引物中有或能加上合適的酶切位點,被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點,這對酶切分析或分子克隆很有好處.⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性
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