不同分光光度計間細菌光密度測定的差異分析
背景
細菌培養(yǎng)基的光密度(OD)測定是微生物學(xué)中使用的一種常見技術(shù)。研究人員主要依靠分光光度計來進行這些測定,然而實際上這個測定是基于培養(yǎng)基的光散射量而不是光吸收量。在其標(biāo)準(zhǔn)配置中,分光光度計并未對光散射測定進行優(yōu)化,這通常會導(dǎo)致儀器間所測得吸光度上的差異。
方法
該研究調(diào)查了不同的分光光度計光學(xué)配置對在分批培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌JM109光密度測定的影響。分光光度計檢測包括了使用陣列檢測的反向光學(xué)系統(tǒng)、基于單色器的傳統(tǒng)系統(tǒng)以及一種配備積分球配件(ISA)的單色器系統(tǒng)。在每個儀器上測定OD600生長曲線,同時,對McFarland進行CFU/mL計數(shù)來進一步對每個光學(xué)系統(tǒng)進行鑒定。
結(jié)果
來自相同光學(xué)配置類別的分光光度計其OD數(shù)據(jù)是相當(dāng)的。用反向光學(xué)系統(tǒng)測定較高OD時數(shù)據(jù)變化更大,這是由較低雜散光所導(dǎo)致?;趩紊鞯南到y(tǒng)測試較高OD時準(zhǔn)確度較高,主要是因為與來自反向光學(xué)系統(tǒng)的多色光相比,單色光具有更好的雜散光去除能力。然而,反向光學(xué)系統(tǒng)測定OD時卻有具有良好的動態(tài)范圍。使用ISA產(chǎn)生出的數(shù)據(jù)與用其它系統(tǒng)產(chǎn)生出的數(shù)據(jù)不同,這是因為其具有捕捉幾乎所有前向散射光的能力。而對McFarland標(biāo)準(zhǔn)品的測定確認(rèn)了這些現(xiàn)象。
結(jié)論
分光光度計進行可靠的光散射測定的能力在很大程度上取決于其光學(xué)配置;因此,具有不同光學(xué)配置的分光光度計會呈現(xiàn)出不同的OD測定值。理想狀態(tài)下,高度散射樣品(如細胞培養(yǎng)基)的吸光度是使用ISA進行測定的,目的是為了捕捉幾乎所有的散射光。培養(yǎng)基生長可使用OD600測定,然而每當(dāng)改變分光光度計時,就應(yīng)該計算和應(yīng)用一個換算因數(shù)。
引言
培養(yǎng)基中細菌生長(遲緩期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定生長期和衰亡期)各個階段都能記錄下來,其中對數(shù)期被認(rèn)為是細菌分裂最快的階段(1)。使用分光光度計測定細菌培養(yǎng)基在600nm(OD600)時的光密度,從而監(jiān)控細菌生長一直是微生物學(xué)中的一種核心技術(shù)。使用細菌OD600的三種更為常見的應(yīng)用如下:(a)在細菌表達蛋白質(zhì)時,找到誘導(dǎo)蛋白的佳時間,(b)用于小抑菌濃度(MIC)實驗的接種體濃度的確定和標(biāo)準(zhǔn)化,和(c)收獲和制備感受態(tài)細胞的時間的確定。研究人員繼續(xù)依靠分光光度計進行這些OD測定。然而,光密度不是一個吸光度指標(biāo),而是細菌混懸液的一種光散射指標(biāo),將其自身作為吸光度顯示(圖1)。分光光度計光學(xué)配置對光密度測定的影響得到了很好的記錄(2-4)。具有不同光學(xué)配置的儀器對同一細菌混懸液測定得到了不同的光密度。分光光度計光學(xué)配置上的差異對觀察到的差異影響。前向光學(xué)系統(tǒng)采用單色光來進行吸光度的測定,而反向光學(xué)系統(tǒng)則利用多色輻射進行測定,光在其穿過樣品后再區(qū)分成單獨波長(圖2)。前向光學(xué)系統(tǒng)的一些要素導(dǎo)致了測得OD值上的差異:(a)樣品與檢測器之間的距離,(b)聚光透鏡的尺寸和焦距大小不同,和(c)檢測器的面積和靈敏度(5)。盡管現(xiàn)在都知道不同的光學(xué)配置會產(chǎn)生不同的OD值,但是研究人員仍繼續(xù)關(guān)注在不同分光光度計間發(fā)現(xiàn)的OD值差異。在本研究中,我們分析了多種光學(xué)配置分光光度計測出的OD值差異。我們在分批培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌JM109,并監(jiān)控OD達9.5小時。在測定之前稀釋培養(yǎng)基,并將由于不同分光光度計光學(xué)元件差異造成的不同OD值進行換算。
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儀器 | 光學(xué)系統(tǒng) | 光學(xué)幾何學(xué) | 光源 | 檢測器 |
Evolution Array | 反向光學(xué) | 氘和鎢燈 | 光電二極管陣列 | |
NanoDrop 2000c | 反向光學(xué) | 氙燈 | CMOS陣列 | |
SPECTRONIC 200 | 反向光學(xué) | 鎢燈 | CCD陣列 | |
Evolution 260 Bio | 前向光學(xué) | 前向光學(xué) | 氙燈 | 硅光電二極管 |
Evolution 300 | 前向光學(xué) | 前向光學(xué) | 氙燈 | 硅光電二極管 |
BioMate 3S | 前向光學(xué) | 雙光束 | 氙燈 | 硅光電二極管 |
結(jié)果
從未稀釋和稀釋的培養(yǎng)基中收集的OD600數(shù)據(jù)如圖3所示。將來自稀釋溶液的OD600值乘以稀釋因數(shù),并與未稀釋的樣品進行對比。兩張圖的分歧表明,不同的光學(xué)配置在光密度測定方面會有不同的動態(tài)范圍。當(dāng)對比每個分光光度計的校正OD值與細胞計數(shù)時,我們發(fā)現(xiàn),隨著時間的推移,具有相似光學(xué)系統(tǒng)的儀器產(chǎn)生了相似的OD曲線(圖4)。具有前向光學(xué)系統(tǒng),但卻是雙光束光學(xué)幾何結(jié)構(gòu)的BioMate 3S,與儀器組的差異大。McFarland數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出一種與大腸桿菌生長相似的曲線(圖5)。ISA使用McFarland標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生了更低的光密度(圖6)。
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圖1結(jié)論
·計算OD測定值時,確定您所用分光光度計的光密度性能和動態(tài)范圍是至關(guān)重要的。為獲得有關(guān)生長曲線的最準(zhǔn)確信息,稀釋細胞混懸液是很重要的。
·OD測定在很大程度上取決于光學(xué)系統(tǒng)和幾何學(xué)。對于相同的混懸液,具有不同光學(xué)系統(tǒng)和配置的分光光度計會讀出不同的OD值。例如,在反向光學(xué)系統(tǒng)Evolution Array和前向光學(xué)系統(tǒng),雙光束BioMate 3S之間有實質(zhì)性的分歧。
?·積分球配件(ISA)可捕捉幾乎所有的前向散射光,從而產(chǎn)生了更低的光密度。這是因為通常看起來被
樣品吸收的散射光實際上是被ISA配件所收集。ISA對測定高度散射溶液中分析成分的吸光度是理想之選;然而,在測定細胞混懸液的光密度時,其是無效的。
·最后,我們提出了如何計算一個可用于使OD數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化,以便能在不同分光光度計間進行適當(dāng)比較的換算因數(shù)。值得注意的是,這個換算因數(shù)是針對一種特定的有機體,因為微粒的尺寸和形狀會影響換算因數(shù)。