結核病實驗室診斷技術
1??結核病實驗室檢測方法
1. 1??病原學檢測
???????1. 1. 1??痰涂片鏡檢??是確診的依據, 也是發(fā)現(xiàn)結核病最經典、最有效的手段( 尤其是對肺結核) 。優(yōu)點是操作簡單, 快速。但此法受限制較多, 比如: 標本采集時間, 標本質量好壞, 是否?？菇Y核藥都直接影響結核菌陽性結果, 對于含菌量少的病例( 如結核性腦膜炎) 檢出率就更低, 降低其價值, 另外, 即使涂片陰性也不能排除結核病。染色常采用萋——尼抗酸染色, 此法陽性檢出率至少要104/ ml, 陽性率僅為30% 左右, 陽性說明抗酸桿菌存在, 而不能區(qū)分是結核桿菌還是非結核桿菌, 由于我國非結核桿菌發(fā)病較少, 故此法對診斷結核病人有重要意義。
???????對L 性抗酸菌常采用改良抗酸染色, 有研究發(fā)現(xiàn), 在慢性病灶內結核桿菌以L 型為主, 此時表現(xiàn)為非特異性淋巴結炎的病理改變, 通過IK 染色, 檢出率高達67%?, 說明染色法有助于提高結核病的病原學診斷。熒光鏡檢有更高的靈敏度, 對于含菌量少的病例, 檢出率高于一般顯微鏡的檢出率, 且所需檢查時間比使用一般顯微鏡檢查少一半多。
???????1. 1. 2??分離培養(yǎng)??由于結核分支桿菌生長緩慢的特點, 使此法耗時費力, 極不適宜于臨床診斷的需要。故采用了改良羅氏和BACTEC 技術。二十世紀70 年代中后期建立起來的BACTEC 技術使結核桿菌快速培養(yǎng)成為可能, 縮短檢測時間。缺點是: 雖然靈敏度高于傳統(tǒng)方法, 但應注意其特異性, 且存在同位素污染, 國外已淘汰。目前應用的是新一代BACTEC 培養(yǎng)技術, 采用BACTEC MGIT960 儀測定, 解決了污染這個問題。從實際應用看, 許多醫(yī)院缺乏開展此技術的條件, 故還不能完全取代傳統(tǒng)的結核分支桿菌培養(yǎng)的方法。
1. 2??免疫學檢測
???????1. 2. 1??結核菌素試驗及其他抗原皮膚試驗??結核菌素試驗( OT 試驗) 是一種傳統(tǒng)的結核病診斷試驗,主要用來了解被試者是否感染了結核分支桿菌或作為有無結核病的輔助依據, 在結核病流行病學方面,可以作為人群感染后結核的危險度的指標。同時, 也是檢測卡介苗接種效果的一種方法。缺點是: 由于是一種間接診斷結核病的方法, 假陽性率高, 極不易標準化?，F(xiàn)在主要用結核菌素純蛋白衍生物( PPD)作檢測。隨著人們對肺結核分支桿菌認識的深入, 在研究區(qū)分結核分支桿菌感染與非結核分支桿菌感染的PPD 試劑已取得了實質性進展。這類制劑有作為菌種鑒定前的篩選手段應用于臨床的前景。PPD試驗作為一種檢測細胞介導的免疫應答方法, 已得到廣泛的承認, 但BCG 接種使用PPD 試驗很難對M.TB 感染作出診斷。PPD 試驗目前在早期診斷及鑒別診斷結核病方面還是一種重要的方法。
???????Nakamura 及其同事最近報道了MPB64 分支桿菌抗原采用鐵復發(fā)應用于活動性結核檢測, 該實驗總的結論為: 對活動性結核的敏感性為98. 1% , 特異性為100% , 準確性為98. 9%。
???????1. 2. 2??免疫血清學檢測??眾多學者已證實, 結核病患者的免疫規(guī)律為: 病變重, 受損范圍大者, 細胞免疫功能弱, 抗體產生多?。即細胞免疫隨病情加重而減弱, 體液免疫隨病情加重而增強。明顯表現(xiàn)為細胞免疫與體液免疫分離的現(xiàn)象。因此, 從70 年代建立了ELISA 法后, 形成了很多以檢測結核抗體為主的免疫血清學檢測方法, 在現(xiàn)代結核病的快速診斷中發(fā)揮著重要作用。
???????(1) 酶聯(lián)免疫吸附法( ELISA 法)??從臨床角度看, 此法應用最廣泛。但會因觀察對象不同, 檢測使用的抗原不同, 質量控制不易等因素影響, 結果差異較大。, 不少學者認為, 此法是目前較為成熟的血清學診斷方法, 不失為結核病有意義的輔助診斷指標之一?。對菌陰肺結核與肺外結核的診斷也同有前途。
???????(2) 結明實驗(Mycodot)???是通過測定血清中之阿拉伯甘露糖(LAM) 抗原達到輔助診斷的目的。只有當患者為活動性結核病時, 才有陽性反應, 對健康人, 受過感染者( 結素試驗陽性) 以及卡介苗接種者都是陰性反應。該法不但特異性, 敏感性高, 且標本采集方便, 方法簡單, 快速, 可靠, 用肉眼判斷實驗結果, 無需實驗儀器, 便于基層醫(yī)院推廣。缺點: 是一種間接診斷結核病的方法, 假陽性率高, 尤其對肺外結核的診斷, 應綜合判斷。
???????(3) ICT-TB 卡??是一種免疫色譜法, 用于檢測血清中抗結核分支桿菌抗體的體外免疫診斷實驗。與其他血清學檢測方法不同的是, 它不是檢測單一抗原抗體, 而是在一次實驗中同時檢測血清標本中5種特異性抗體, 彌補了宿主體液免疫反應的差異性。國內一些學者應用此法對結核病的診斷價值作了探討, 顯示該法有較高特異性, 能快速檢測結核抗體對結核病的診斷及鑒別有較好臨床價值, 并且操作簡單, 快速, 無需任何設備, 適用于各級醫(yī)院, 尤其適用于對門診患者做出快速診斷。
???????(4) 免疫膠體金標記技術( ICS)???具有快速、簡便、準確的特點, 有助于提高診斷。適用于活動性結核病的診斷、涂片培養(yǎng)陰性有臨床癥狀者, 肺癌與其他肺部疾患的鑒別診斷, 結核病化療動態(tài)觀察, 艾滋病混合感染者。但目前該方法檢測成本較高, 尚難在結核病初篩及基層普及應用。
???????(5) 重氮乳凝法??以新型免疫載體重氮乳膠建立的一種乳凝法。曾年華等學者對此方法的應用作了探討、比較, 認為該法不但具有敏感、特異、操作簡便的優(yōu)點, 而且檢測成本低廉, 在初診中具有良好效果, 適合結核病初篩及基層普及應用?。
???????血清學方法為結核病的快速、準確診斷提供了廣闊前景, 而尋找敏感性和特異性均高的單體蛋白作為血清學檢測結核病的特異性抗原是血清學診斷的重要研究方向。正如馬鈺和王敬萍所言: 經歷了一個世紀, 血清學法發(fā)展的道路是漫長的, 仍有許多問題要探索與研究?。
1. 3??分子生物學技術
???????1. 3. 1??聚合酶鏈反應( PCR)??1989 年Hance 等人首先將PCR 用于結核分支桿菌的檢測, 1990 年我國引進該技術, 從而在我國開辟了以PCR 為代表的分子生物學技術檢測結核分支桿菌的階段?。PCR 的特點是靈敏度高, 特異性強, 簡便, 快速。PCR 可以檢測出1~ 100fg 純化分支桿菌DNA, 相當于1~ 20 個結核桿菌。由于非特異反應及檢測結果使用電泳法等原因, 造成一定的假陽性及假陰性結果的存在。隨著對PCR 技術的改進, 定量PCR 技術越來越受到重視, 主要有AmpliSensor PCR, 譚耀駒等人已將該技術應用于結核分支桿菌的檢測; 分子燈塔技術( molecular beacon) , Piatek 等將此技術已應用于結核分支桿菌rpoB 基因突變檢測, 該技術主要用于同源雜交檢測。定量PCR 的優(yōu)勢是: 1、擴增和檢測均在密閉系統(tǒng)中, 對實驗室污染的可能性大大降低; 2、擴增和檢測全自動化, 工作效率大大提高?。由于特異性探針的引入, 在檢測階段去除了一些非特異性擴增產物, 無疑提高了檢測的特異性, 但目前此技術在結核桿菌檢測方面文獻較少, 還不能客觀評價臨床檢測價值。
???????1. 3. 2??核酸探針技術( DNA Probe)???主要測定結核分支桿菌同源性序列的標記核酸片斷或序列。主要的類型有cDNA 探針、全染色體DNA 探針、克隆的NDA 探針、寡核苷酸探針。目前已有商業(yè)性核酸探針試劑盒用于臨床鑒定一些重要的分支桿菌, 在結核分支桿菌的分子生物學研究, 細菌分類與鑒定, 流行病學調查等方面有十分重要的作用, 此法快速, 敏感, 特異?。缺點是檢測的靈敏度不夠理想, 因而需依賴培養(yǎng)或與其他技術聯(lián)合應用, 不能直接檢測臨床標本; DNA 探針目前只能鑒定少數幾種分支桿菌; 技術較復雜或需要專門儀器。
???????1. 3. 3??DNA 指紋技術??將結核分支桿菌的基因組DNA 采用特殊的技術切割成大小不同的片斷, 電泳分離, 就可以清楚地看到象人的皮膚指紋一樣具有特征性的條帶, 這就是結核分支桿菌的DNA 指紋。建立結核分支桿菌DNA 指紋的主要技術有: 限制性片斷長度多態(tài)性( RFLP) 方法, PCR 方法; 由上述兩種技術衍生出來的幾種方法, 如以RFLP為基礎的( GTG) 5DNA 指紋方法, 以PCR 為基礎的DR DNA 指紋方法等。RFLP 方法具有良好的特異性和穩(wěn)定性, 已成為結核分支桿菌株水平鑒定的主要方法; 而PCR 法簡單快速, 但特異性和穩(wěn)定性不及RFLP 方法, 只是作為RFLP 方法的補充。由于選用的結合分支桿菌基因組DNA 特征片斷不同, 所形成的指紋圖譜不同, 目前大多采用的是Van Embden 等的IS6110為基礎的DNA 指紋圖譜。此法可以在種、株水平結核分支桿菌進行鑒定, 在流行病學研究和耐藥檢測方面已取得了很多成果, 對基因組的研究在快速檢測耐藥基因和鑒別非結核分支桿菌更有高時效性?。隨著DNA 指紋標準方法的推廣, 在全球范圍追蹤結核病傳染源, 查證傳播途徑, 篩選高危人群的工作等應用前景廣闊。但由于瓊脂糖凝膠電泳難以辨別眾多帶譜, 結果不理想, 影響了此法在臨床上的應用。
???????1. 3. 4??DNA 芯片技術??將結核分支桿菌DNA 的保守片段分段固定在芯片上, 與結核分支桿菌DNA 雜交, 以檢測結核分支桿菌。設計的集成化, 微型化和操作的并行性, 使得對數千個基因表達情況的同時分析或基因性檢測成為可能。目前還未被廣大的專業(yè)技術人員掌握, 但有廣泛的應用前景, 在疾病遺傳因素的解析、治療疾病以及發(fā)現(xiàn)并證實藥物作用的靶位點等方面將極有價值。
2??現(xiàn)代結核病診斷的新特點
2. 1??多種方法聯(lián)合應用診斷, 優(yōu)勢互補, 提高檢出率
???????如王國斌等學者探討了使用痰聚合酶鏈反應( PCR) 檢測TB- DNA 的方法?, 使用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測血清結核分支桿菌胞壁糖脂免疫球蛋白( LAM- IgG) 、卡介苗免疫球蛋白G( PPD- IgG) 、結合特異性免疫復合物( SCIC) 及PPD 皮試5 種方法聯(lián)合用于菌陰肺結核的診斷結果顯示, 聯(lián)合檢測陽性率明顯增加, 而特異性僅稍降低, 對于菌陰肺結核, 為探討敏感性和特異性均高的方法, 聯(lián)合檢測已成為人們探索的新領域?。
2. 2??對原有方法的改進、拓寬
???????2. 2. 1??尋找特異性, 敏感性高的包被抗原??特異的抗原是提高免疫學檢測敏感性的重要環(huán)節(jié)。十幾年來, 國內外學者一直從結核分支桿菌培養(yǎng)濾液中提純蛋白質Ag 進行了多方面的研究。近年來, 利用基因工程技術克隆表達了多種結核分支桿菌分泌性抗原, 如PMT63, ESAT- 6,MPT64, 38kDa 等。研究表明, 這些分泌蛋白參與結核病的免疫反應?。因此, MPT63 等抗原作為血清學診斷的新型Ag 正在被研究。
???????2. 2. 2??免疫檢測指標的豐富??傳統(tǒng)免疫學方法主要檢測結核抗體、抗原。隨著分子免疫學的深入發(fā)展, 檢測的內容豐富化, 如: 對活動性結核標志物( ATM) 的檢測?; 全血IFN- γ檢測等。董德瓊等人的研究也表明, 血清TGF- β的檢測可作為反映結核病人免疫功能判斷病情。
2. 3??結合其它學科技術的發(fā)展
???????單純的細菌學檢查、免疫學檢查、基因診斷方法都不可能適應現(xiàn)代疾病的診斷, 隨著人類科學技術的進步, 對疾病認識的深入, 疾病的診斷技術也在不斷改革, 以適應發(fā)展。如傳統(tǒng)的免疫學檢查與放射學檢查結合, 與計算機的結合; 基因芯片技術與壓電傳感器技術形成的電基因傳感器芯片就是一類新興檢測技術?。
3??展望
???????二十世紀90 年代末, 結核分支桿菌全部基因組測序工作已完成。進入二十一世紀, 醫(yī)學界有人大膽推測, 醫(yī)學將進入分子基因時代, 而基因研究將進入后基因時代?, 充分利用基因組豐富的信息, 運用一切分子生物學技術, 有望找到新的診斷方法。
