重疊延伸PCR簡(jiǎn)介
重疊延伸PCR技術(shù)(gene splicing by overlap extension PCR,簡(jiǎn)稱(chēng)SOE PCR)由于采用具有互補(bǔ)末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈,從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸,將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái).此技術(shù)利用PCR技術(shù)能夠在體外進(jìn)行有效的基因重組,而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理,可利用這一技術(shù)很快獲得其它依靠限制性?xún)?nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物.重疊延伸PCR技術(shù)成功的關(guān)鍵是重疊互補(bǔ)引物的設(shè)計(jì).重疊延伸PCR在基因的定點(diǎn)突變、融合基因的構(gòu)建、長(zhǎng)片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴(kuò)增等方面有其廣泛而獨(dú)特的應(yīng)用。
以下是重疊延伸PCR的原理及兩基因的引物設(shè)計(jì)：
A基因：
上游（F1）與開(kāi)放閱讀框起始密碼子附近的序列相對(duì)應(yīng)，并在5 ’末端添加酶切位點(diǎn)和3個(gè)保護(hù)堿基；下游（R1）與B基因終止密碼子附近的序列及A基因5’末端起始密碼子附近的序列互補(bǔ)，并去除A基因的終止密碼子TAA
B基因：
上游（F2）與A基因終止密碼子附近的序列及B基因5 ’端起始密碼子附近的序列相對(duì)應(yīng)，同樣去除A基因終止密碼子TAA；下游（R2）與B基因的開(kāi)放閱讀框終止密碼子序列互補(bǔ)，并在5’末端添加酶切位點(diǎn)和2個(gè)保護(hù)堿基。
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先分別用F1、R1，F2、R2擴(kuò)增出A和B基因，然后再用F1和R2將兩基因連接起來(lái)，得到融合基因。
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