定點突變技術(shù)――從單點突變到多點突變
體外定點突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系的有力工具，也是我們在實驗室中改造/優(yōu)化基因常用的手段。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，二者之間的關(guān)系是蛋白質(zhì)組 研究的重點之一。
對某個已知基因的特定堿基進行定點改變、缺失或者插入，可以改變對應(yīng)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，對突變基因的表達產(chǎn)物進行研究有助于我們了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，探討蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)/結(jié)構(gòu)域。
而利用定點突變技術(shù)改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的綠色熒光蛋白（wtGFP）是在紫外光激發(fā)下能夠發(fā)出微弱的綠色熒光，經(jīng)過對其發(fā)光結(jié)構(gòu)域的特定氨基酸定點改造，現(xiàn)在的GFP能在可見光的波長范圍被激發(fā)（吸收區(qū)紅移），而且發(fā)光強度比原來強上百倍，甚至還出現(xiàn)了黃色熒光蛋白，藍色熒光蛋白等等。
（1）應(yīng)用領(lǐng)域
定點突變技術(shù)的潛在應(yīng)用領(lǐng)域很廣，比如研究蛋白質(zhì)相互作用位點的結(jié)構(gòu)、改造酶的不同活性或者動力學(xué)特性，改造啟動子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是穩(wěn)定性、活性、研究蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，以及藥物研發(fā)、基因治療等等方面。
對于單點突變，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不錯的選擇，通過巧妙設(shè)計，將質(zhì)粒定點突變技術(shù)變得簡單有效。準(zhǔn)備突變的質(zhì)粒必須是從常規(guī)E.coli中經(jīng)純化試劑盒(Miniprep)或者氯化銫純化抽提的質(zhì)粒。
設(shè)計一對包含突變位點的引物（正、反向），和模版質(zhì)粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循環(huán)延伸”，(所謂的循環(huán)延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端終止，再經(jīng)過反復(fù)加熱褪火延伸的循環(huán)，這個反應(yīng)區(qū)別于滾環(huán)擴增，不會形成多個串聯(lián)拷貝。)正反向引物的延伸產(chǎn)物退火后配對成為帶缺刻的開環(huán)質(zhì)粒。
DpnI酶切延伸產(chǎn)物，由于原來的模版質(zhì)粒來源于常規(guī)大腸桿菌，是經(jīng)dam甲基化修飾的，對DpnI敏感而被切碎（DpnI識別序列為甲基化的GATC，GATC在幾乎各種質(zhì)粒中都會出現(xiàn)，而且不止一次），而體外合成的帶突變序列的質(zhì)粒由于沒有甲基化而不被切開，因此在隨后的轉(zhuǎn)化中得以成功轉(zhuǎn)化，即可得到突變質(zhì)粒的克隆 。
這個試劑盒非常巧妙的利用甲基化的模版質(zhì)粒對DpnI敏感而合成的突變質(zhì)粒對DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模版質(zhì)粒，得到突變質(zhì)粒，使得操作簡單有效。
另外由于Pfu聚合酶是公認的最好的高保真聚合酶之一，堪稱高保真聚合酶的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，是Stratagene的看家之寶，能夠有效避免延伸過程中不需要的錯配。試劑盒采用的是低次數(shù)的循環(huán)延伸而非PCR，有助于減少無意錯配。只需要一次酶切和轉(zhuǎn)化，實驗可以在一天完成。這個試劑盒適用于質(zhì)粒大小不超過8Kb的質(zhì)粒。
QuikChange XL site-directed mutagenesis kit則是針對大于8Kb的質(zhì)粒的定點突變的，通過優(yōu)化試劑特別是其感受態(tài)細胞（XL10-Gold），使得較大的質(zhì)粒的定點突變也一樣簡單。QuikChange由于操作簡單快速，效率高（>80%）而受到普遍歡迎，光是今年的前9個月就有超過400篇發(fā)表的論文中用到這個產(chǎn)品。
（2）產(chǎn)品介紹
定點突變的比較有特色的產(chǎn)品還有Clontech公司的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit，需要根據(jù)準(zhǔn)備突變的質(zhì)粒自行設(shè)計兩條引物（同一方向，對同一單鏈模版），一條包含計劃定點突變的序列，另一條引物包含質(zhì)粒上某一個單酶切位點，不過在單酶切位點中引入突變，這樣兩條引物除了所包含的突變位點，其他序列和質(zhì)粒上對應(yīng)位置的序列完全一致，退火后和質(zhì)粒模版結(jié)合，通過T4 DNA聚合酶延伸，延伸反應(yīng)持續(xù)直到碰到另一條引物停止，兩段包含突變位點的延伸產(chǎn)物經(jīng)T4連接成環(huán)，和模版鏈組成雜和環(huán)，帶有兩處錯配。
單酶切反應(yīng)產(chǎn)物，直接轉(zhuǎn)化Ecoli BMH 71-18 mutS(錯配修復(fù)缺陷株)。原來的雙鏈質(zhì)粒模版被切開而不能轉(zhuǎn)化，而雜和質(zhì)粒由于一條鏈上單酶切位點引入突變而不被切開，保持環(huán)狀質(zhì)粒得以轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化子的雜和雙鏈在E.coli的復(fù)制過程中分開，再經(jīng)過一輪提質(zhì)粒、單酶切、轉(zhuǎn)化，最后得到純和的突變質(zhì)粒。這個試劑盒則是利用改造單酶切位點使得新合成的突變質(zhì)粒不被切開從而除去原來的模版質(zhì)粒。雖然這個試劑盒比上一個麻煩，但實際上是引入了兩個定點突變。只不過一個用于酶切除掉模版的反應(yīng)。
（3）多位點定點突變
有的時候研究可能需要多個位點的定點突變，比如改造酶的活性或者動力學(xué)特性，研究蛋白之間的相互作用位點等，單點突變不能滿足實驗的需要，重復(fù)進行單點突變也非常浪費時間。因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。
最多一次實驗可以引入5個定點突變。這個試劑盒的原理和Clontech的相似，就是準(zhǔn)備多個帶突變的引物（同方向，對同一單鏈模版），退火后全部突變引物（不超過5個）都結(jié)合在同一環(huán)狀單鏈模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一個引物就停止，各片斷經(jīng)連接成環(huán)，和單鏈模版組成雜和環(huán)，DpnI消化雙鏈模版，也消化雜和環(huán)中的模版，只留下新合成的帶多個突變的單鏈環(huán)（mutant ssDNA），得以轉(zhuǎn)化E.coli，形成雙鏈質(zhì)粒。
資料表明，引入3個定點突變的效率為60%，5個定點突變的效率為30%。得到的其他質(zhì)粒是帶有較少定點突變的質(zhì)粒，以引入3個定點突變?yōu)槔?，就是?0% 左右的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒是帶有1―2個不同定點突變的質(zhì)粒（因為存在1―2個引物結(jié)合模版延伸形成單鏈環(huán)的可能）。這樣，一次實驗可以得到不同數(shù)目突變的質(zhì)粒，對于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系也是有用的。
不同于定點突變的是基于PCR的隨機突變，通過改變PCR條件提高PCR過程中的隨機出錯，這種方法適用于未知的蛋白質(zhì)，作全局性分析，所以有人稱為飽和突變（saturation mutagenesis）。
不過這種方法由于沒有目的性，分析操作相當(dāng)繁瑣，并且不會出現(xiàn)一個位點2個以上堿基突變，因而應(yīng)用上有局限性。定點突變適用于蛋白結(jié)構(gòu)已有初步了解的基因，比PCR隨機突變更有目的性，也更為精確，簡單，同時改造基因更加“隨心所欲”。由于定點突變技術(shù)在蛋白質(zhì)組 學(xué)中有這非常廣泛的應(yīng)用前景，相信這個技術(shù)在不遠的將來還會有更大的改進和發(fā)展，也必將為更多人熟悉應(yīng)用。
