綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記亞細(xì)胞定位
一、原理
利用綠色熒光蛋白(GFP)來示蹤胞內(nèi)蛋白的技術(shù)。利用GFP融合蛋白技術(shù)來進(jìn)行活細(xì)胞定位研究是目前較為通行的一種方法，在光鏡水平進(jìn)行研究，不需要制樣，沒有非特異性標(biāo)記的影響。并且GFP的分子量為27kD，經(jīng)激光掃描共聚集顯微鏡激光照射后，可產(chǎn)生一種綠色熒光，從而對蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定位。
激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM,
以下簡稱共聚焦顯微鏡）因其獨(dú)特的設(shè)計(jì)原理，有效地排除了非焦平面信息，提高了分辨率及對比度，使圖像更為精確清晰，因此極其適于進(jìn)行活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等定位及活體動(dòng)態(tài)研究。
二、主要步驟
1．真核表達(dá)載體的構(gòu)建
①引物設(shè)計(jì)
利用引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)pEGFP-N1的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)目的基因引物：
②載體構(gòu)建
將PCR產(chǎn)物酶切后插入pEGFP-N1，得到表達(dá)目的基因與EGFP融合蛋白質(zhì)的真核表達(dá)載體。
2．轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞
當(dāng)細(xì)胞生長到對數(shù)生長期時(shí)，接種到共聚焦顯微鏡專用的玻璃底培養(yǎng)皿（35mm petri dish，10 mm
Microwell）中，培養(yǎng)過夜。當(dāng)細(xì)胞貼壁率達(dá)到30%~50%時(shí)，將表達(dá)載體質(zhì)粒2ug和脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)
2ml分別溶于100 ml無抗生素、無血清的DMEM培養(yǎng)基中，充分混勻后，室溫放置15 min，再將兩種溶液充分混勻，室溫放置30
min。同時(shí)用無血清、無抗生素的DMEM洗滌待轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞2~3次，向DNA-脂質(zhì)體混合物中加入800
ml無抗生素、無血清的DMEM培養(yǎng)基，混合后加入到培養(yǎng)細(xì)胞中。培養(yǎng)皿放入37℃孵箱孵育6~8 hr后吸去雙無培養(yǎng)液，加入2~3
ml含抗生素和10% FCS的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24~72 hr。
4．激光掃描共聚焦顯微鏡觀察
將上述細(xì)胞分別在24、、36、48、72小時(shí)用共焦顯微鏡觀察，采用激光掃描共聚焦顯微鏡，激發(fā)波長為488nm，采取圖像。
