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液質(zhì)聯(lián)用中的質(zhì)譜——串聯(lián)質(zhì)譜篇(中)

2023.9.19

  本文舉幾例常見的串聯(lián)質(zhì)譜儀,篇幅較長分為上、中、下三篇。

  線性離子阱LIT/FTICR和LIT/Orbitrap

  QqQ和QTOF都是串聯(lián)兩個“離子束”型分析器,近年來還有一種趨勢是串聯(lián)兩個離子捕獲型分析器,線性離子阱LIT/FTICR是此類最早的類型,由于維護(hù)困難,近年來慢慢被LIT/Orbitrap所取代。離子在不同質(zhì)量分析器間的傳輸,不是連續(xù)的離子束傳輸,而是先在LIT中累積,再以離子包的方式,用C-Trap傳輸?shù)絆rbitrap中。實驗中,LIT和Orbitrap可以同時進(jìn)行質(zhì)量掃描,提升Duty Cycle和分析效率。

  Orbitrap相對于FT-ICR的弱點是,Orbitrap在內(nèi)部無法碎裂離子,無法在Orbitrap分析器中直接進(jìn)行MSn,而是等待前級傳來的碎片離子MSn,再進(jìn)行高分辨率分析。但Orbitrap除了維護(hù)簡單,還有一些優(yōu)勢。兩者都是記錄像電流,放大后經(jīng)FT變換,因此靈敏度與信噪比相近,差異在于分辨率。對于ICR,分辨能力反比于質(zhì)荷比;對于Orbitrap,分辨能力反比于質(zhì)荷比的平方根,因此隨著質(zhì)荷比增加,Orbitrap的分辨能力比ICR下降更為緩和。小于m/z 300,ICR分辨能力高;大于m/z 300,在相同的檢測時間下,ICR分辨能力下降的幅度大于Orbitrap。超過m/z 4000后,ICR的分辨能力降到比Orbitrap更低。因此大分子分析中,Orbitrap更優(yōu)。

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ICR與Orbitrap的分辨能力與質(zhì)量關(guān)系圖。兩種質(zhì)量分析器分辨能力均隨質(zhì)荷比增加而下降,而Orbitrap下降的幅度較ICR緩和,在更高質(zhì)荷比時分辨率優(yōu)于ICR

  四極桿/軌道阱(Q/Orbitrap)以及三重串聯(lián)質(zhì)譜儀

  四極桿和Orbitrap串聯(lián)時,主要利用設(shè)置于末端的高能碰撞解離(HCD)池執(zhí)行HCD模式。HCD專指Orbitrap類儀器中離子在高能碰撞池或多級離子通道中的碎裂方式,相比于CID碎裂方式能獲得低m/z的碎片離子,產(chǎn)生的碎片相對更多,譜圖質(zhì)量更高。Q/Orbitrap的最新型號如Orbitrap Exploris系列,體積緊湊可作為桌上型儀器。

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Orbitrap Ascend Tribrid儀器示意圖

  Orbitrap還可同時結(jié)合四極桿和線性離子阱成為三重串聯(lián)質(zhì)譜儀,如最新型號Orbitrap Ascend Tribrid,平臺的三重特性通過多種碎裂技術(shù)、多通路性(并行分析,即用一臺分析儀隔離離子,同時用另外兩臺分析儀進(jìn)行檢測)和同步母離子選擇 (SPS) 實現(xiàn)了功能擴(kuò)展。這里的C-Trap 有前置多級離子通道,用于離子儲存和MS2碎裂;還有后置多級離子通道。以蛋白質(zhì)組學(xué)定量實驗為例,圖中所示綠、藍(lán)、黃色的不同離子正在同步進(jìn)行不同的運(yùn)動。綠色離子先被選擇后到Orbitrap后獲得高分辨MS譜,然后經(jīng)前置多級離子通道HCD碎裂后送入LTQ后續(xù)的檢測器獲得MS/MS,又到LTQ獲得MS3,同時累積富集藍(lán)色離子;接下來將綠色離子的MS3送入Orbitrap獲得高分辨譜,同時將藍(lán)色離子做HCD碎裂,然后重復(fù)前面綠色離子的過程。圖中所示,當(dāng)富集黃色離子時,綠色離子將完成高分辨MS3,藍(lán)色離子的MS3正等待送入Orbitrap。

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蛋白質(zhì)組學(xué)定量實驗:TMTpro SPS MS3方法

  Ascend上還具有CID、 ETD, UVPD, PTCR 和MSn

  HCD 等多種解離模式(后文會專門介紹各種解離模式)。將三個質(zhì)量分析器協(xié)同工作的模式,與不同的解離模式搭配,使Ascend Tribrid具有多種可以操控的組合模式。

  2023年,賽默飛又推出了新型Orbitrap Astral質(zhì)譜儀,它也是一個三重串聯(lián)質(zhì)譜儀,包括四極桿、Orbitrap、Astral三個質(zhì)量分析器。Ascend中,LTQ的譜圖采集速度大概是50Hz,而Astral可以達(dá)到200Hz(每秒采集200張MS/MS譜);同時Astral可以獲得8萬分辨率的MS/MS譜,只是Astral無法如LTQ再進(jìn)行MS3實驗。未來,三個質(zhì)量分析器還可以通過協(xié)同工作,產(chǎn)生更多的實驗流程。

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Orbitrap Astral示意圖

  離子淌度質(zhì)譜

  離子淌度(Ion Mobility)有時譯為離子遷移,出現(xiàn)早期也被稱氣相電泳,可以獨(dú)立使用,也可以配合質(zhì)譜使用。最早的研究始于1950s,因其結(jié)構(gòu)簡單、快速、靈敏、小巧便攜適于揮發(fā)物檢測,在安檢、化學(xué)武器、爆炸物與毒品檢測、在線檢測等領(lǐng)域,可獨(dú)立使用,原理與TOF類似,但不需要高真空。離子淌度的核心原理是電場驅(qū)動下離子在氣體阻尼環(huán)境中的遷移速率產(chǎn)生差異而分離。本文只介紹同質(zhì)譜配合使用的離子淌度。

  一種應(yīng)用是安裝在質(zhì)譜儀的離子源與真空接口之間,使用氣相差分離子淌度來分離共洗脫化合物、同分異構(gòu)化合物以及隱藏在高背景噪聲中的化合物。其代表是SCIEX的SelexION技術(shù)和賽默飛的FAIMS技術(shù)。

  SCIEX的離子淌度差分質(zhì)譜分離技術(shù)(Differential Mobility Spectrometry, DMS) 又叫差分離子淌度。SelexION DMS裝置由兩塊平行金屬電極(10×30mm,1mm間隔)構(gòu)成,置于curtain (離子源簾氣)和 orifice(采樣錐)之間,在大氣壓條件下工作,結(jié)構(gòu)簡單耐用,拆裝無需破壞質(zhì)譜真空系統(tǒng)。分離電壓 (SV) 垂直于輸送氣流的方向應(yīng)用至整個離子傳輸通道,由于高電場和低電場離子淌度系數(shù)之間的差異,離子向壁遷移并離開飛行路徑。 它們的軌跡通過稱為補(bǔ)償電壓 (COV) 的平衡 DC 電壓校正。DMS 技術(shù)記錄在一定范圍的 SV 振幅下校正特定離子的軌跡所需的 COV。 可以掃描 COV 以根據(jù)離子的差分淌度連續(xù)傳遞離子,或者將其設(shè)置為固定值以僅傳遞具有特定差分淌度的離子種類。

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SelexION工作原理示意圖

  DMS通過降低化學(xué)噪聲及預(yù)分離相似質(zhì)量的離子,提高質(zhì)量分析的質(zhì)量和定量準(zhǔn)確性。在 SV 和 COV 設(shè)置為零時允許無差別傳輸所有離子。DMS支持同時傳輸兩種極性的離子,并根據(jù)它們的差分淌度常數(shù)分別進(jìn)行分離。

  FAIMS(High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry,高場非對稱波形離子遷移譜)和SelexION類似,只是兩電極由內(nèi)部圓柱電極、外部環(huán)電極組成,離子在電場的驅(qū)動下繞過中心圓柱電極。工作時,離子在氣流的攜帶下移動,在兩電極上加上兩組電壓:周期不對稱方波 DV 和補(bǔ)償電壓 CV。DV 是周期性的高/低電壓交替。由于高/低電壓所對應(yīng)的遷移率不同,離子會呈現(xiàn)鋸齒狀軌跡,且每個周期都會有一小段垂直方向上的位移。在此基礎(chǔ)之上,若疊加固定的補(bǔ)償電壓CV,則滿足特定差分遷移率(高場下遷移率與低場下遷移率的差值,因此 FAIMS 也叫差分離子淌度)的離子能夠平穩(wěn)地飛過電場,其它離子則會撞到極板上,這就實現(xiàn)了離子選擇。若隨時間改變CV即可實現(xiàn)對不同離子的掃描,電壓范圍一般為-50V~10V。

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賽默飛FAIMS Pro Duo高場非對稱波形離子遷移譜

  離子淌度的另一種應(yīng)用是在質(zhì)譜內(nèi)部,強(qiáng)調(diào)為傳統(tǒng)質(zhì)譜增加新的分離維度,提升信噪比,并可分辨同分異構(gòu)體、多電荷態(tài)。離子淌度質(zhì)譜自Waters 2006年推出SYNAPT 開始,在很多高端QTOF質(zhì)譜中配置,如安捷倫于2009年推出6540,布魯克于2016年推出timsTOF。離子淌度裝置的位置在離子傳輸Q0區(qū)或碰撞室Q2區(qū),淌度分離是第一目標(biāo),后來從timsTOF開始發(fā)現(xiàn)有富集離子的作用,在和TOF的脈沖配合后有提升Duty Cycle的作用,即在TOF脈沖進(jìn)樣的間隔富集離子,在進(jìn)樣時把所有的離子送入TOF。由于四極桿Q1是連續(xù)流傳輸離子的,所以淌度裝置在Q1前端Q0區(qū)和Q1后端Q2區(qū)都能發(fā)揮同樣的作用(當(dāng)然,如果不用淌度裝置,用阱類裝置也可以達(dá)到富集離子,提升Duty Cycle的效果)。

  離子淌度使傳統(tǒng)質(zhì)譜除了按質(zhì)量和電荷數(shù)之外,還可以根據(jù)離子的尺寸和形狀分析樣品,為研究人員提供了傳統(tǒng)質(zhì)譜所不能獲取的特異性信息。該技術(shù)所獲取的4維數(shù)據(jù)信息,包括色譜保留時間、質(zhì)譜質(zhì)荷比、淌度漂移時間、離子強(qiáng)度。通過軟件能夠?qū)ζ渲械娜我舛S或三維信息進(jìn)行自由選取或可視化處理。

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安捷倫6560離子淌度QTOF示意圖

  安捷倫2021年最新的6560C離子淌度QTOF的工作原理為:入口離子漏斗聚焦,進(jìn)入捕集漏斗,累積一定量離子后,打開ion gate,向漂移管(約80cm長)注入離子。離子依次通過漂移管,進(jìn)入出口離子漏斗,再次聚焦,進(jìn)入后級Q1四極桿。使用安捷倫高分辨率多重性分解 (HRdm 2.0) 軟件進(jìn)行后處理,可實現(xiàn)高達(dá) 200 的全譜離子淌度分辨率。

  沃特世有獨(dú)特的各種“Wave“技術(shù),用于Q0和碰撞室,如ScanWave,StepWave,Travelling-Wave行波(簡稱T-Wave)技術(shù)等,主要是為了提升傳輸效率。T-Wave技術(shù)用于QTOF碰撞室,在原有碰撞室氣體的基礎(chǔ)上加更多的氣體,由于不同尺寸大小的離子碰撞截面積不同,阻力也不同,因此能把不同形態(tài)的離子分開,即離子淌度。沃特世在2006年推出高清質(zhì)譜SYNAPT HDMS,目前最新型號為SYNAPT XS。

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沃特世SYNAPT系列離子淌度QTOF示意圖

  首先離子在TRAP T-Wave中蓄積,然后被釋放到IMS T-Wave中,完成離子分離。隨后離子通過TRANSFER T-Wave 傳輸至質(zhì)量分析器。其工作周期約幾十毫秒。注意,IMS離子淌度分離發(fā)生在Q1后的碰撞池中。2015年,沃特世還推出了VION,和6560類似,淌度池在離子源和Q1之間的Q0區(qū)。

  2019年沃特世發(fā)布了環(huán)形淌度 SELECT SERIES Cyclic IMS ,用緊湊型環(huán)形離子導(dǎo)向裝置替代傳統(tǒng)的線性離子淌度區(qū)域,可以控制離子進(jìn)行一圈或多圈的淌度分離,淌度分辨率可從單圈的65提升到多圈的400,甚至有研究報道至100圈時可獲得750的淌度分辨率。鍍金電極陣列固定于PCB板上,多功能T-WAVE 陣列控制離子多種模式,除了可以根據(jù)選擇做多圈的淌度分離后送入TOF,還可以從離子組合中選擇并分離出某個離子,并以CID活化重新注入,進(jìn)而可獲得IMSn(n最多為5級)。

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沃特世SELECT SERIES Cyclic IMS環(huán)形淌度質(zhì)譜儀示意圖

  2016年,Bruker推出timsTOF,淌度分辨率從原來市場上的40 提升到 近200,關(guān)鍵技術(shù)是TIMS (Trapped Ion Mobility Spectrometry) 捕集離子淌度,其位置在Q1前。

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TIMS原理示意圖

  氣流攜帶離子進(jìn)入逆向梯度電場(像一個加了坡度的跑步機(jī)),若氣流速度與離子的遷移速率相等則離子相對于漂移管靜止,即不同離子依其淌度差異,分布在不同電場強(qiáng)度的位置。離子截面越大,離子淌度越小,維持靜止所需的電場強(qiáng)度越高,即穩(wěn)定在高場區(qū)域。此時若逐漸降低電壓,即實現(xiàn)掃描。若改變電場梯度分布還可選擇性釋放出單一淌度值的離子,即SA-TIMS (selected accumulation-TIMS)。其工作氣壓約0.2 ~ 0.5 KPa。傳統(tǒng)的2米長的遷移管,分辨率約等于80左右;而只需要一個5厘米長的TIMS部件,由于流速可調(diào),將流速增加至漂移距離約等于10米,R即可約等于180。

  隨后,布魯克推出了雙TIMS的timsTOF Pro和隨后的系列,并和Matthias Mann合作發(fā)布Parallel Accumulation–Serial Fragmentation (PASEF) 平行累積連續(xù)碎裂技術(shù)。它使用了兩組 TIMS,離子在第一個TIMS部分中進(jìn)行累積,然后進(jìn)入第二個TIMS完成淌度分離,分離后的離子繼續(xù)MS/MS碎裂,隨后重復(fù)該步驟。而在PASEF過程中,當(dāng)?shù)诙€TIMS進(jìn)行分離時,第一個TIMS也同時在平行地累積離子,這樣可以實現(xiàn)近乎100%的離子利用率。對于蛋白質(zhì)組學(xué)來說,大幅提升靈敏度和序列覆蓋率;同時結(jié)合了離子淌度的4D分離技術(shù),能夠?qū)崿F(xiàn)碰撞橫截面( CCS )的分析,也在蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)應(yīng)用中發(fā)揮了巨大作用。

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雙TIMS支持的dia-PASEF? 增加組學(xué)鑒定可信度

接下來請見下篇:液質(zhì)聯(lián)用中的質(zhì)譜:串聯(lián)質(zhì)譜(下)

目錄:

前言:液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)簡述

Chapter1、液質(zhì)聯(lián)用中的液相色譜

Chapter2、液質(zhì)聯(lián)用中的質(zhì)譜

2.1離子源

2.2離子傳輸

2.3 質(zhì)量分析器

2.4串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem Mass Spectrometry,MS/MS)

2.5 檢測器

2.6 真空系統(tǒng)

Chapter3、液質(zhì)聯(lián)用中的數(shù)據(jù)采集和分析



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