快速 PCR 定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)
試劑、試劑盒 ATPdNTP 溶液SDM 緩沖液Taq DNA 聚合酶克隆化的 Pfu DNA 聚合酶Taq Extender PCR 添加劑Dpn I 限制性內(nèi)切酶T4 DNA 連接酶模板 DNAdsDNA 質(zhì)粒LB 瓊脂平板
儀器、耗材 FALCON 2059 管子或替代物熱循環(huán)儀水浴或適當(dāng)?shù)募訜嵫b置提前設(shè)定為 37°C、42°C、72°C 溫箱瓊脂糖凝膠電泳試劑和裝置
實(shí)驗(yàn)步驟
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
ATP(10 mmol/L)
dNTP 溶液（包含所有 4 種 dNTP, 每一種 6.25 mmol/L)
SDM 緩沖液，10X(20 mmol/L Tris-HCl、pH7.5,8 mmol/L MgCl2，40ug/ml BSA)
2. 酶和酶緩沖液
Taq DNA 聚合酶
克隆化的 Pfu DNA 聚合酶（Stratagene)
Taq Extender PCR 添加劑（Stratagene)
Dpn I 限制性內(nèi)切酶
T4 DNA 連接酶
3. 核酸和寡核苷酸突變引物
模板 DNA,dsDNA 質(zhì)粒，小量或大量制備 [O.5pmol 模板=(0.33ug/kb)X 模板大小（kb)]
摸板 DNA 必須有甲基化的 Gm6 ATC 序列，如果沒(méi)有，在進(jìn)行 PCR-SDM 之前必須在體外用 Dam 甲基化酶進(jìn)行甲基化。
只有包含抑菌抗生素抗性基因（如青霉素、四環(huán)素和氯霉素）的質(zhì)粒適用于這個(gè)快速方案，也能夠使用包含殺菌抗生素抗性基因（如卡那霉素和鏈霉素）的質(zhì)粒，但在應(yīng)用抗生素選擇之前必須使被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有一個(gè)生長(zhǎng)的過(guò)程。參見(jiàn)第 14 步的注釋。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 突變引物 [15pmol 引物=(5ng/堿基）X 引物大?。▔A基）]
在一條或兩條引物上有磷酸基團(tuán)十分重要，這種引物能夠被 T4 多聚核苷酸激酶磷酸化或者直接合成 5'末端磷酸基團(tuán) 。
4. 培養(yǎng)基
LB 瓊脂平板（10 g 細(xì)菌培養(yǎng)用酪氨酸，5 g 細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物，10gNaCl, 加 H20 至 1L, 最終 pH7.0, 每升加入 15 g 瓊脂）
5. 特殊設(shè)備
FALCON 2059 管子或替代物
熱循環(huán)儀
水浴或適當(dāng)?shù)募訜嵫b置，提前設(shè)定為 37°C、42°C、72°C
溫箱，提前設(shè)定為 37°C
小離心管
6. 載體和菌株
E.coli 熱休克感受態(tài)細(xì)胞（例如，XLl-blue，Statagene)
7. 附加項(xiàng)目
選項(xiàng)：瓊脂糖凝膠電泳試劑和裝置，包括溴化乙錠 (參見(jiàn)步驟 9）
二、方法
1.PCR
(1) 冰上，在一個(gè)已滅菌好的離心管中，混合 PCR-SDM 反應(yīng)物。
模板 DNA ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?0.5pmol
SDM 緩沖液，10X ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?2.5ul
dNTP 溶劑（6.5 mmol/L) ? ? ? ? ? ? 1ul
突變引物 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?每種 15pmol
H20 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?補(bǔ)齊至 24ul
?
(2) 加入 2.5U 的 Taq DNA 聚合酶和 2.5U Taq Extender PCR 添加劑。
這些酶能夠混合在一起，并且能夠以 1:1(體積比）的混合物形式在-20°C 儲(chǔ)存至少 3 個(gè)月。
(3) 按照如下的 PCR 條件進(jìn)行 7~12 個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。
可以根據(jù)不同種類的設(shè)備和反應(yīng)體系對(duì)時(shí)間和溫度作出相應(yīng)的調(diào)整，參見(jiàn) 31.2 PCR 注意事項(xiàng)。
如果熱循環(huán)儀沒(méi)有熱蓋，則要使用礦物油成石蠟來(lái)防止在 PCR 過(guò)程中反應(yīng)混合物的蒸發(fā)。
2. 消化和拋光 PCR-SDM 產(chǎn)物
(4) 在 PCR 反應(yīng)之后，將反應(yīng)產(chǎn)物放置在冰上冷卻 2 min。
(5) 將如下的組分直接加入到 25ul 擴(kuò)增產(chǎn)物中。
Dpn I 限制性內(nèi)切酶（10U/ul)1ul
Pfu DNA 聚合酶（2.5U/ul)1ul
如果在循環(huán)中使用礦物油覆蓋在反應(yīng)物上，那么在消化、拋光和連接過(guò)程中向反應(yīng)管中加入附加組分的時(shí)候，一定要將微量移液器的尖端插入到礦物油層之下。
(6) 輕輕混合，然后將反應(yīng)物置于一個(gè)離心管中離心 lmin。立即將反應(yīng)物置于 37°C 溫育 30 min。
(7) 將反應(yīng)物置于 72°C 再溫育 30 min。
3.PCR-SDM 產(chǎn)物的連接
(8) 將下列組分添加到用 Dpn I 和克隆化的 Pfu DNA 聚合酶處理過(guò)的產(chǎn)物中。
H2O ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?100ul
SDM 緩沖液，10X ? ? ? ? ? ? ? ? ?10ul
ATP,10mmol/L ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 5ul
(9) 輕輕混合，然后將反應(yīng)物罝于一個(gè)離心管中離心 1min。
可選做：為了證明 PCR-SDM 產(chǎn)物的完整性，從樣品中取出 5ul 在標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳中分析。應(yīng)該能夠觀察到單一條帶。
(10) 從上述反應(yīng)物中取出 10ul 置于一個(gè)已滅菌的離心管中，加入 4U 的 T4 DNA 連接酶 (4U/ul)。
似乎不同批次的 T4 DNA 連接酶對(duì)于平端 DNA 分子的連接能力有相當(dāng)?shù)牟煌?。這導(dǎo)致了突變效率的變化，在這種方法中，效率變化的范圍可以從 30%~70%。一旦發(fā)現(xiàn)一批質(zhì)量好的酶，推薦將其保存起來(lái)專門(mén)用作 PCR-SDM。
(11) 在 37°C 將反應(yīng)物溫育1h。
4. 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（快速轉(zhuǎn)化方案）
(12) 將熱休克感受態(tài)細(xì)胞在冰上輕輕地解凍，然后取出 40ul 細(xì)胞到一個(gè)預(yù)冷的 FALCOL2059 聚丙烯管中。
(13) 向細(xì)胞中加入 1ul 連接酶處理過(guò)的 DNA，輕柔地?cái)嚢瑁诒戏胖?30 min。
(14) 在 42°C 熱激 30s，然后在冰上放置 2 min。
已經(jīng)針對(duì) FALCON2059 管優(yōu)化過(guò)熱激的條件了，如果采用不同的管，反應(yīng)條件應(yīng)該重新做相應(yīng)的優(yōu)化。
如果使用的質(zhì)粒包含有殺菌型抗生素抗性基因，在冰上放置 2 min 后，需要添加 260ul LB, 在 37°C、250r/min 的條件下?lián)u動(dòng) 30 min, 然后繼續(xù)第 15 步操作。
(15) 立即將所有體積的感受態(tài)細(xì)胞放置到包含有適當(dāng)選擇性抗生素的 LB 瓊脂平板上涂板。將平板在 37°C 放置過(guò)夜。
