許國旺：代謝組學(xué)方法學(xué)和臨床應(yīng)用研究應(yīng)該雙翼齊飛

2021.7.08

　　分析測試百科網(wǎng)訊 在各種多組學(xué)中，代謝組學(xué)研究是后起之秀，但近年來進入轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)診療的速度很快。代謝組學(xué)究竟是如何發(fā)展起來的？為何轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用的速度更快？未來的發(fā)展趨勢如何？近日，分析測試百科網(wǎng)采訪了中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所、代謝組學(xué)研究中心主任許國旺研究員，希望他的探索和系統(tǒng)的闡述能夠激勵更多的研究者開展代謝組學(xué)研究，并將其推進到精準(zhǔn)診療的廣闊天地……

中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所代謝組學(xué)研究中心主任許國旺研究員

　　“代謝組學(xué)的臨床應(yīng)用其實最早出現(xiàn)在70年代初”，許國旺的回顧讓我們大長見識。上世紀(jì)七十年代初，質(zhì)譜（MS）方法開始應(yīng)用于新生兒代謝的出生缺陷檢查，是最早的代謝組學(xué)臨床應(yīng)用。隨著基因組計劃的實施和完成，出現(xiàn)了蛋白質(zhì)組學(xué)，同時對代謝物的作用有所忽視。一直到上世紀(jì)末期人們開始重新意識到：代謝物在生化網(wǎng)絡(luò)中起著非常重要的作用，科學(xué)家們才重新回過頭來研究小分子。2001年開始，代謝組學(xué)得到快速發(fā)展。

　　在代謝組學(xué)的發(fā)展過程中，我國的研究基本和國際同步。2004-2005年前后，以大連、上海、武漢、北京等地的一些單位的研究為代表，推動中國代謝組學(xué)的發(fā)展?！?002年我曾在上海生化細胞所做代謝組學(xué)報告，聽會的人不是特別多；2003年年底，中國科學(xué)院在上海生命科學(xué)院召開了關(guān)于‘植物、微生物代謝組學(xué)和代謝工程’學(xué)術(shù)研討會，本人受邀做了題為‘植物、微生物代謝組學(xué)技術(shù)平臺的研究’的報告，會場座無虛席，與會科研人員和青年學(xué)生對代謝組學(xué)所表現(xiàn)出的熱情與2002年的情景形成鮮明對比?！?/span>

　　代謝組學(xué)是研究分子量1500以下的內(nèi)源性小分子的科學(xué)，應(yīng)用覆蓋疾病診斷、機理研究等各方面。此前人們認為代謝物是末端產(chǎn)物，沒有什么功能了；現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)代謝物與同基因、蛋白同等重要的、構(gòu)筑生命體的模塊；在核酸、蛋白生化作用的過程中，小分子也參與了調(diào)控。從文獻來看，上世紀(jì)50年代研究小分子代謝的文章很多，但到80-90年代發(fā)一篇CNS很難；本世紀(jì)初開始改觀，尤其是最近5年，CNS每周均有小分子的文章發(fā)表，表明人們越來越重視代謝組學(xué)、小分子功能、小分子調(diào)控。

不識廬山真面目只緣身在此山中

　　談到自己和代謝組學(xué)的結(jié)緣，許國旺說：“1995年我拿到德國馬普研究基金到德國工作，最早我從事氣相色譜研究，當(dāng)時想轉(zhuǎn)生命科學(xué)方向，就申請到德國Tuebingen大學(xué)醫(yī)學(xué)院工作。醫(yī)學(xué)院根據(jù)我原來研究色譜的背景，安排我研究尿中代謝產(chǎn)物同惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。在德國工作兩年回國后，我們課題組就開辟了新方向：研究代謝同健康的關(guān)系?！?/span>

　　“我們最初用毛細管電泳、液相色譜開展研究，漸漸開始用GC-MS、LC-MS，但未想到這正是代謝組學(xué)的前奏。2001年在同中國科學(xué)院上海生科院吳家睿副院長交流時，他告訴我一個非常新的名字，即代謝組學(xué)。那是我第一次聽到這個名詞，到網(wǎng)上查到Jeremy Nicholson在1999年定義了metabonomics（代謝組學(xué)）概念的文獻，才知道我們的工作已經(jīng)踏入了這個熱點新興領(lǐng)域的大門?！?/span>

披荊斬棘開路先鋒

　　那時全球都沒有代謝組學(xué)的專用儀器，沃特世（Waters）是介入最早的公司。2003年沃特世（日本）的一位經(jīng)理想邀請許國旺在中國組織一個研討會，但籌備數(shù)月后離職了。一年多后，沃特世（中國）的舒放經(jīng)理和許教授再聯(lián)系，2004年10月在上海舉辦了中國第一次代謝組學(xué)研討會。彼時中國的代謝組學(xué)研究剛剛萌芽，因此定位于高層研討會。在楊勝利院士的幫助下，許國旺出面邀請了可能會對代謝組學(xué)感興趣的國內(nèi)參會專家。除許國旺本人外，代謝組學(xué)先驅(qū)英國帝國理工學(xué)院的Jeremy Nicholson教授和美國Waters公司代謝組學(xué)專家Robert Plumb博士，都在會上作了精彩講演。

　　許國旺繼續(xù)回憶到：“2004年會議后代謝組學(xué)在中國慢慢熱起來。大連化物所和沃特世成立了‘代謝組學(xué)聯(lián)合實驗室’，2004年7月我受邀到新加坡在代謝組學(xué)研討會上做報告。2004~2005年沃特世推出第一臺專門用于代謝組學(xué)的質(zhì)譜儀Q-TOF Micro MS，我們實驗室成為他們的第一個中國用戶。后來的幾年，我們在上海、大連等地同沃特世聯(lián)合組織了幾次藥物代謝組學(xué)會議。”

　　“2003-2004年，中科院上海植物所的陳曉亞所長組織了植物代謝組學(xué)的項目，我在其中。此時，有的單位也開始申請和使用代謝組學(xué)實驗室的名稱?？磥砦覀円残枰⒋x組學(xué)的Flag了?！痹S國旺說。2005年7月，在包信和所長和生物技術(shù)部主任楊勝利院士的支持下，大連化物所掛牌建立“代謝組學(xué)研究中心”，并邀請科技部基礎(chǔ)司張先恩司長為中心揭幕。后來的幾年，中心除了沃特世代謝組專用質(zhì)譜，也添置了島津、SCIEX、安捷倫、賽默飛等各公司的質(zhì)譜，并開展不同的合作。

　　方法學(xué)研究

　　代謝組學(xué)研究中心有幾大研究方向，首先是方法學(xué)研究。許國旺所在實驗室是中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點實驗室。代謝組學(xué)起初只是概念，后來才有專用儀器，彼時的軟件、方法都不成熟。因此，課題組從建立方法開始，再開發(fā)數(shù)據(jù)處理軟件，自建方法和工具后再回頭開展“發(fā)現(xiàn)”研究。

　　在方法學(xué)上，課題組已建立了幾十個方法，從一維到二維，從靶向到擬靶向、到非靶向等各個層次。許國旺打了個比方：“我非常自豪地講，就像去飯店點菜一樣，我們建立了各種專門的方法，來適合于不同的代謝組學(xué)分析需求?！?/span>

　　許國旺課題組發(fā)展了一種擬靶向（Pseudotargeted）的代謝組學(xué)方法，將靶向和非靶向相結(jié)合，被國際上多個實驗室采用，UC DAVIS的Oliver Fiehn教授稱此類方法為第二代代謝組學(xué)方法，尤其適合大規(guī)模代謝組、脂質(zhì)組學(xué)的分析。目前課題組已建立包含2000多個代謝物的擬靶向代謝組學(xué)分析方法和包含19個脂類，3377個脂質(zhì)離子對，覆蓋7000多種脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的擬靶向脂質(zhì)組學(xué)分析方法。8年研究的相關(guān)結(jié)果和軟件已發(fā)表在Nature Protocols上。

從非靶向（左）向擬靶向（右）脂質(zhì)組分析的轉(zhuǎn)變示意圖

　　代謝組學(xué)應(yīng)用

　　課題組已將代謝組學(xué)方法應(yīng)用于多個領(lǐng)域，如臨床、植物、微生物、中醫(yī)藥等。實驗證明，臨床是代謝組學(xué)最有成效的應(yīng)用領(lǐng)域。課題組同許多三甲醫(yī)院開展合作研究，如上海東方肝膽醫(yī)院，上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院，上海第六人民醫(yī)院，上海第九人民醫(yī)院，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，鄭州大學(xué)附屬第一醫(yī)院等，并已取得多項研究成果。

　　第一方面是標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。全球已發(fā)表多于150,000個所謂的標(biāo)志物，但真正在醫(yī)院用的少于100個。課題組發(fā)現(xiàn)了幾個有前途的代謝物作為疾病潛在標(biāo)志物，用于對肝癌風(fēng)險的預(yù)測，糖尿病視網(wǎng)膜病變的預(yù)測等，正準(zhǔn)備進一步做多中心驗證，并申請專門的試劑盒。前些年開發(fā)的《血清甘膽酸檢測試劑盒-液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法》已獲批臨床醫(yī)療器械證，可在醫(yī)院使用。

膽汁酸試劑盒

　　許國旺強調(diào)說：“我們的平臺是開放式的，去年報中國分析測試學(xué)會CAIA獎的時候助手統(tǒng)計，先后有上百家單位曾經(jīng)用我們的平臺來開展代謝組學(xué)研究，近五年就有約50家單位（/次）?！?/span>

許國旺團隊“基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的高覆蓋代謝組學(xué)方法開發(fā)及應(yīng)用”榮獲2020年度中國分析測試協(xié)會科學(xué)技術(shù)獎（CAIA獎）特等獎

　　第二個方面是治療，代謝紊亂作為治療靶點也非常吸引人，去年SCIENCE專門有文章綜述此專題。課題組同鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院余祖江教授合作，研究治療慢加急性肝衰竭的方法。該合作重點研究急性肝損傷過程中代謝如何紊亂。發(fā)現(xiàn)代謝紊亂的途徑，然后找到合適的藥物來糾正細胞中的紊亂，增加細胞活力。研究發(fā)現(xiàn)，慢加急性肝衰竭患者中主要紊亂是脂肪酸氧化上調(diào)，糖酵解下調(diào)。根據(jù)代謝組學(xué)研究結(jié)果，余祖江團隊用TMZ（曲美他嗪，trimetazidine，可治療心絞痛）來抑制脂肪酸氧化，讓代謝流回歸到糖酵解，增加肝細胞活力，從而治療急性肝損傷。132例隨機對照臨床實驗證明TMZ治療可顯著改善肝衰竭患者的預(yù)后。TMZ已獲得美國FDA批準(zhǔn)享受孤兒藥的地位來治療急性肝損傷，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院已將此作為治療急性肝損傷的常規(guī)方法使病人受益。

　　第三方面是代謝重編程的研究。腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的明顯特征是能量代謝紊亂。腫瘤細胞為了生存和高速倍增，對代謝途徑和代謝行為進行重編程。比如腫瘤細胞主要利用糖酵解途徑快速提供ATP供自身生長，腫瘤細胞還會消耗大量的葡萄糖并產(chǎn)生大量的乳酸來適應(yīng)其細胞生長。腫瘤細胞還會根據(jù)外界營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和不同的應(yīng)激條件，選擇不同的代謝方式產(chǎn)生供自身使用的ATP和生物大分子。這時候整個代謝網(wǎng)絡(luò)改變。代謝組學(xué)可研究疾病發(fā)生發(fā)展過程中，代謝的途徑、代謝網(wǎng)絡(luò)如何變化，即代謝重編程。

代謝組學(xué)研究和應(yīng)用的現(xiàn)狀

　　談到方法學(xué)，許國旺表示，代謝組學(xué)研究的兩大主要工具是NMR（核磁共振）和質(zhì)譜，兩者是互補關(guān)系。NMR是無損檢測，相對比較簡單和穩(wěn)定；但質(zhì)譜靈敏度更高，比NMR高2-3個數(shù)量級，同時具有大量豐富的碎片信息，可以推測結(jié)構(gòu)。

　　代謝組學(xué)使用的質(zhì)譜主要有兩類，一類是高分辨質(zhì)譜，用于“全景式”研究代謝，一般來說，3萬以上分辨率的質(zhì)譜基本可以滿足非靶向代謝譜的采集，主要用于“發(fā)現(xiàn)”。另一類是三重四極桿質(zhì)譜，主要用于做精準(zhǔn)定量。上述兩類質(zhì)譜可配合使用，實現(xiàn)從發(fā)現(xiàn)到驗證的代謝組學(xué)研究。

　　在“大海撈針”式的發(fā)現(xiàn)階段，高分辨質(zhì)譜用于盡可能多和全地測出代謝組，再用多變量、單變量方法來篩選出差異代謝物。比較不同組的差異發(fā)現(xiàn)差異代謝物是代謝組學(xué)研究的核心。但代謝標(biāo)志物的確定，需要擴大樣本，進行多中心、不同人群、干擾疾病等的驗證，這時用三重四極桿質(zhì)譜。

　　代謝組學(xué)另一重要目標(biāo)是研究機理，從代謝層面，開展細胞實驗、動物實驗、多組學(xué)等研究；結(jié)合體內(nèi)體外實驗，找出重要的差異代謝物也是關(guān)鍵。將機理研究和標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)工作結(jié)合的代謝物組學(xué)研究成果，將有更大的潛力推廣到臨床。

　　許國旺強調(diào)說：“代謝組學(xué)的發(fā)現(xiàn)和臨床應(yīng)用是兩個不同的階段，發(fā)現(xiàn)階段大多數(shù)是研究過程，步驟復(fù)雜并需要高精深技術(shù)，需要科研人員來完成。在此基礎(chǔ)上，鎖定那些有功能的代謝物或代謝標(biāo)志物，再推廣到臨床，這是第二步。在發(fā)現(xiàn)和臨床應(yīng)用之間還有很多過程，包括擴大樣本量、多中心、臨床檢驗方法報批等。代謝組學(xué)從研究到臨床的路徑不短?！?/span>

　　許國旺還介紹了脂質(zhì)組學(xué)的知識。首先，脂質(zhì)組是代謝組的一種，但為什么要單列？這是因為，脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)非常有特點，其分子骨架碳鏈非常有規(guī)律。其次脂肪酸、磷脂、甘油酯等種類也非常多，高達數(shù)十萬種。最后，脂質(zhì)組的樣品預(yù)處理和普通代謝物不同。脂質(zhì)組學(xué)同生理、生化、病理等功能非常密切，同心血管病、糖尿病、腫瘤等疾病密切相關(guān)，近年來成為一個獨立分支受到研究者重視。PubMed上的一些綜述顯示，很多心血管病的生物標(biāo)志物都是脂質(zhì)，還有一些如ceramide（神經(jīng)酰胺類)，實際上是細胞生與死的開關(guān)，具有非常重要的功能。

　　近十年間，觀察PubMed的文獻可知，參與到代謝組學(xué)領(lǐng)域的人越來越多，文章數(shù)量高速上升。這是因為，代謝組學(xué)研究的是終端產(chǎn)物，同疾病發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)。所以Jeremy Nicholson等在《C&EN》（美國化學(xué)工程）上發(fā)表綜述說，用代謝組學(xué)研究臨床問題，省錢、更接近于解決實際問題。

為什么代謝組學(xué)轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用更快？

　　許國旺表示，近年來代謝組學(xué)研究隊伍迅速增長，臨床上更對代謝組學(xué)給予厚望。基因反映疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，蛋白實現(xiàn)功能，基因變化了但不一定發(fā)病。比如青少年糖尿?。∕OD）是單基因疾病，有些人該基因有突變，但四十多歲時還沒有發(fā)病，因此說基因突變是發(fā)病的必要條件但不是充分條件。從代謝角度來看，如果代謝異常，則指示疾病已發(fā)生。因此用代謝組學(xué)來研究疾病更接近于實際問題，相對于其他組學(xué)更節(jié)省成本。

　　關(guān)于多組學(xué)的標(biāo)志物進入臨床，許國旺表示：“那是苦差事，過程非常漫長，無論哪種組學(xué)都非常不容易?！贝x組學(xué)的臨床應(yīng)用如新生兒代謝紊亂、出生缺陷，理論上可以篩100余種疾病，但真正臨床上做篩選的只有30余種，因為篩選出來需有藥物治療才有意義。當(dāng)前已進入臨床應(yīng)用的標(biāo)志物如葡萄糖、膽固醇、同型半胱氨酸、激素、維生素D、肌酐、尿酸等都是代謝物。許國旺認為，標(biāo)志物臨床應(yīng)用的未來可能是組合標(biāo)志物，用多組學(xué)研究獲得的多個標(biāo)志物組合（panel）診斷一種疾病或評價藥物的治療有效性。特別是，如果將大分子蛋白和小分子代謝物組合在一起，靈敏度和特異性都能提升。因為疾病的發(fā)生發(fā)展過程不是一個途徑，不是一個代謝物或者一個蛋白在起作用，可能整個網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)改變。所以用Panel檢測，在關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)中找?guī)讉€標(biāo)志物，將提升靈敏度和特異性。即在網(wǎng)絡(luò)醫(yī)學(xué)時代，多標(biāo)志物檢測將是必然趨勢。

臨床質(zhì)譜：診斷和研究都很重要

　　談到臨床應(yīng)用的國內(nèi)外對比，許國旺表示：臨床質(zhì)譜在中國被描繪為未來千億的市場，很多投資正進入該領(lǐng)域。未來首先要做到規(guī)范化，其次是推動更多的方法得到認可，并真正和健康結(jié)合。LDT是實驗室自建方法后得到相關(guān)部門的認可，但需確保該方法有用。根據(jù)產(chǎn)品風(fēng)險程度由低到高，體外診斷試劑分為第一類、第二類、第三類產(chǎn)品。比如腫瘤診斷一定是III類，要獲得國家級認可；除已明確為第一類、第三類的產(chǎn)品，其他為第二類產(chǎn)品，省級認可即可。盡管描繪未來千億級藍海市場，但其實現(xiàn)在我國獲得醫(yī)療器械注冊證認可的質(zhì)譜方法不多。未來需要質(zhì)譜方法學(xué)的研究者和臨床檢驗醫(yī)生更好地結(jié)合，取得醫(yī)療器械注冊證認可才能讓更多質(zhì)譜方法進臨床。

　　許國旺特別強調(diào)說，我們談到的臨床質(zhì)譜不只是針對臨床輔助診斷，用質(zhì)譜還可開展很多臨床研究（暨醫(yī)學(xué)研究）。其實，質(zhì)譜發(fā)揮作用最大的領(lǐng)域是質(zhì)譜作為新的工具進入到臨床研究；不能片面認為只有輔助診斷，臨床研究可能是更重要的。

　　許國旺認為，臨床代謝組學(xué)未來的難點和挑戰(zhàn)是：第一，如何真正將代謝組學(xué)同臨床問題結(jié)合，去解決臨床實際問題。第二，要求擴大樣本量，對研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果進行驗證。第三，要做到方法的不可替代性，讓方法具有生命力。

　　如何應(yīng)對上述挑戰(zhàn)？許國旺認為：首先，分析化學(xué)的研究者要建立可靠、可重復(fù)的方法。其次，臨床醫(yī)生要找準(zhǔn)問題，找到代謝組學(xué)擅長解決的問題來做，兩者要結(jié)合起來。最后，臨床問題要轉(zhuǎn)變成科學(xué)問題，分析化學(xué)家要與臨床醫(yī)生緊密合作，同時聯(lián)合生物化學(xué)、細胞生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、大數(shù)據(jù)等才能真正發(fā)揮作用及解決問題。

代謝組學(xué)需要的硬軟件

　　許國旺認為，代謝組學(xué)對儀器的要求是穩(wěn)定和重復(fù)。臨床樣本是不可復(fù)制的，在實驗原始數(shù)據(jù)存盤后，有些色譜質(zhì)譜峰當(dāng)時無法鑒定，但過幾年儀器或方法有新突破后，應(yīng)可以回頭再來挖掘這些數(shù)據(jù)。

　　代謝組學(xué)是一個交叉學(xué)科，參與者包括分析化學(xué)家、臨床醫(yī)生、分子生物學(xué)以及相關(guān)數(shù)據(jù)處理的研究人員。每一領(lǐng)域的進步都將推動代謝組學(xué)的進步。在發(fā)現(xiàn)階段，盡可能使用高精尖的儀器，但到醫(yī)院臨床使用時需要的是“傻瓜機”。不排除下列情況：研究階段用高精尖的質(zhì)譜，真正應(yīng)用時同質(zhì)譜沒有關(guān)系，如用特異性的光學(xué)或免疫的檢驗方法。代謝組學(xué)研究和應(yīng)用涉及非常長的鏈條，試劑盒、前處理等各行各業(yè)都可參與發(fā)揮作用。在臨床應(yīng)用時，質(zhì)譜法的好處是可以一次檢測多個標(biāo)志物，而且靈敏、準(zhǔn)確。

　　代謝組學(xué)轉(zhuǎn)化為臨床檢測當(dāng)前存在的問題是，理論上醫(yī)療器械注冊證可以批準(zhǔn)多標(biāo)志物檢測的質(zhì)譜方法，但實際審批時需要講清楚每個標(biāo)志物的意義。這樣很難，因為可能正是多個標(biāo)志物共同指示了疾病或共同產(chǎn)生了功能，單個標(biāo)志物無法說清楚。

代謝組學(xué)發(fā)展趨勢

　　從近幾年的發(fā)展趨勢來看，2010年之前代謝組學(xué)研究在概念階段，很多研究是把原來的一些體系用代謝組學(xué)方法運行一遍，來證明代謝組學(xué)的可用性。2010年后的10年取得非常明顯的進步，代謝組學(xué)全面深入臨床、藥物發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域去解決實際問題。當(dāng)前代謝組學(xué)關(guān)注兩大方向的趨勢，一個是大隊列人群，因為要解決臨床問題用幾十個樣本是不可能的，需要分析數(shù)百到數(shù)萬個臨床樣本；并同多組學(xué)整合，比如代謝組學(xué)同基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)特別是腸道菌群整合研究。另外一大趨勢是，在越來越復(fù)雜的同時，追求越來越精細化，分析更少量的細胞甚至單細胞，近年來空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的興起也促生了空間代謝組學(xué)，單細胞代謝組學(xué)成為非常大的熱點。

　　除了將代謝組學(xué)研究逐漸轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用，當(dāng)前還可以用實時原位質(zhì)譜技術(shù)指導(dǎo)手術(shù)過程，比如判斷是否是腫瘤組織、如何切除，代謝組學(xué)干預(yù)手術(shù)進程的方法越來越多，這是非常前沿的工作。在從標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、驗證、臨床報批方面，也涌現(xiàn)越來越多的應(yīng)用。在藥物開發(fā)過程中，毒性研究結(jié)果對最后的新藥成敗影響甚大，代謝組學(xué)可在藥物研究初期就介入毒性研究，進一步減少風(fēng)險，輔助藥物開發(fā)進程，比如英國聯(lián)合全球幾大制藥公司組織了COMET項目。在藥物開發(fā)早期用代謝組學(xué)介入減少毒性，淘汰不良藥物，控制開發(fā)風(fēng)險，取得很大成功。