基因定點(diǎn)突變step by step
本文先講最簡(jiǎn)單的一個(gè)點(diǎn)的定點(diǎn)突變技術(shù)，其它較長(zhǎng)片段的突變，刪除，插入技術(shù)以后會(huì)慢慢奉上：
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在做實(shí)驗(yàn)之前，我們首先要搞清楚實(shí)驗(yàn)的目的和實(shí)驗(yàn)的原理。
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實(shí)驗(yàn)的目的應(yīng)該比較明確吧：就是要把自己的基因上面的一個(gè)堿基換成另外一個(gè)堿基。一般情況下我們會(huì)有幾種可能使我們需要這樣去做：
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第一 我們吊出來(lái)的基因有點(diǎn)突變，相信這可能是大家經(jīng)常會(huì)遇到的問(wèn)題?；蚝貌蝗菀椎醭鰜?lái)，并裝進(jìn)了自己的載體，卻發(fā)現(xiàn)有一兩個(gè)堿基跟自己的預(yù)期序列或所有的公共數(shù)據(jù)庫(kù)不匹配，然后暴昏。
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大家實(shí)驗(yàn)室里面還是用Taq酶為主吧，Pfu這樣的高保真酶大家應(yīng)該用得不多吧，Taq酶的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)都很明顯：優(yōu)點(diǎn)就是擴(kuò)增效能強(qiáng)，缺點(diǎn)就是保真性差，其錯(cuò)配機(jī)率是比較高的，相關(guān)數(shù)字忘了，大家可以去網(wǎng)上查那個(gè)數(shù)字，不過(guò)感覺(jué)如果是2000bp的基因，如果擴(kuò)四五十個(gè)循環(huán)的話，很大機(jī)率會(huì)出現(xiàn)點(diǎn)突變，當(dāng)然這也跟具體PCR體系里的Buffer有很大關(guān)系，詳細(xì)情況這里就不討論了。
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第二 要研究基因的功能，在基因上自己選定位置更換堿基的保守序列，或者改造成不同的亞型，總之就是要人工改造堿基序列符合自己的實(shí)驗(yàn)需要，相信這也是那些研究基因的人經(jīng)常的一種思路吧。
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對(duì)于第一種情況：我們首先要分析出現(xiàn)堿基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如說(shuō)是三聯(lián)密碼子的最后一位，堿基的改變并沒(méi)有引起相應(yīng)氨基酸的改變，那么一般情況下也可以不去理它。另外，在NCBI上人類的基因的版本一直在變化，也就是說(shuō)同一個(gè)基因有不同的版本，或者稱不同的亞型，其堿基序列有些許的差異，只要自己克隆出來(lái)的堿基序列與其中一個(gè)相匹配，一般也就可以不做定點(diǎn)突變了。如果有時(shí)間沒(méi)錢(qián)，那干脆重新PCR然后再克隆進(jìn)自己的載體了，不過(guò)最好換個(gè)保真性好一點(diǎn)的酶如PFU，或者PCR循環(huán)數(shù)低一點(diǎn)，不過(guò)這些東西有時(shí)候也得靠運(yùn)氣啦。實(shí)在不行的話再來(lái)做定點(diǎn)突變。
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對(duì)于第二種情況：這種情況下一般也就只能做定點(diǎn)突變了。
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接下來(lái)開(kāi)始聊一聊定點(diǎn)突變的原理吧。
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那個(gè)Stratagene試劑盒！上面有一個(gè)說(shuō)明書(shū)，說(shuō)得好像很正規(guī)，不過(guò)上面好多都是什么ZL啊什么注意之類的話，看都不看，我們簡(jiǎn)明扼要地只講實(shí)驗(yàn)方面，通過(guò)設(shè)計(jì)引物，并利用PCR將模板擴(kuò)增出來(lái)，然后去掉模板，剩下來(lái)的就是我們的PCR產(chǎn)物，在PCR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個(gè)點(diǎn)變過(guò)來(lái)了，然后再轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆，再測(cè)序確定就行了。
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大家馬上就會(huì)想到幾個(gè)問(wèn)題了：
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第一：引物怎么設(shè)計(jì)呢？
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第二：模板怎么去掉呢？
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第三：怎么拿到質(zhì)粒呢？
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對(duì)于第一個(gè)問(wèn)題：怎么設(shè)計(jì)引物？
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我只能講一些原則，并舉一些例子。
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引物設(shè)計(jì)的原則其它貼子上都有講，這里就不重復(fù)了。不過(guò)這種突變引物要加上一個(gè)原則：一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長(zhǎng)度至少為11-12base pair。
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若兩邊引物太短了，很可能會(huì)造成突變實(shí)驗(yàn)失敗，大家應(yīng)該都知道，引物至少要11-12個(gè)base pair才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以兩邊最好各設(shè)至少12個(gè)base pair，并且合成多一條反向互補(bǔ)的引物。
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這么說(shuō)大家可能不是很清楚，那我就舉個(gè)例子吧：
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X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960
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現(xiàn)有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924
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X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020
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現(xiàn)有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984
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（上面為目的序列，下面為現(xiàn)有序列：我們發(fā)現(xiàn)有一個(gè)A堿基的缺失，其直接結(jié)果是在表達(dá)蛋白時(shí)后面的氨基酸全部錯(cuò)配）
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我們以它為中心設(shè)計(jì)引物：兩邊各至少12個(gè)堿基，左邊由于含有較多的A造成引物GC%含量過(guò)低，故拉長(zhǎng)引物使GC%含量不至過(guò)低，也使引物退火溫度升高。
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故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG
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并合成反向互補(bǔ)引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG
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其實(shí)也不一定要反向互補(bǔ)序列，只要反向引物也是兩邊都有大于12個(gè)堿基，同時(shí)符合引物設(shè)計(jì)的原則就行了。
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引物合成公司有很多家，大家可以去尋找，不同廠家的引物在價(jià)錢(qián)質(zhì)量上有一些差別，不過(guò)價(jià)錢(qián)一般都是一塊多一個(gè)堿基，合成時(shí)間約為一周。
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這樣的結(jié)果是PCR時(shí)把整個(gè)質(zhì)粒都給擴(kuò)出來(lái)了，得到的PCR產(chǎn)物是一條鏈完整，另一鏈有缺刻的PCR產(chǎn)物。
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對(duì)于第二個(gè)問(wèn)題：
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怎么去掉模板呢？再簡(jiǎn)單的方法就是用DpnI酶，DpnI能夠識(shí)別甲基化位點(diǎn)并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒，從大腸桿菌里提出來(lái)的質(zhì)粒一般都被甲基化保護(hù)起來(lái)（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR產(chǎn)物都是沒(méi)有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質(zhì)粒）而不會(huì)影響PCR產(chǎn)物，從而去掉模板留下PCR產(chǎn)物，所以提質(zhì)粒時(shí)那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不會(huì)那么湊巧吧。
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關(guān)于第三個(gè)問(wèn)題：
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直接把通過(guò)DpnI處理的PCR產(chǎn)物拿去做轉(zhuǎn)化就行了，呵呵，然后再篩選出陽(yáng)性克隆，并提出質(zhì)粒，拿去測(cè)序（這個(gè)就不用我多說(shuō)了吧），驗(yàn)證突變結(jié)果，一般都沒(méi)問(wèn)題的啦，我做了幾十個(gè)突變了，到目前為止還沒(méi)有做不出來(lái)的。
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下面講一下具體的實(shí)驗(yàn)步驟以及一些實(shí)驗(yàn)中要注意的事情
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1、 根據(jù)現(xiàn)有基因設(shè)計(jì)引物；
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2、 合成引物并準(zhǔn)備好模板；
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3、 PCR，
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4、 DpnI處理酶切產(chǎn)物；
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5、 轉(zhuǎn)化酶切產(chǎn)物；
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6、 篩選 陽(yáng)性克隆；
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7、 送測(cè)序并測(cè)全長(zhǎng)。
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最后就是慶祝啦，沒(méi)什么復(fù)雜的。
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引物和質(zhì)粒都準(zhǔn)備好后，當(dāng)然就是做PCR嘍，不過(guò)對(duì)于PCR的酶和buffer，不能用平時(shí)的，我們做PCR把整個(gè)質(zhì)粒擴(kuò)出來(lái)，延伸長(zhǎng)度達(dá)到幾個(gè)K，所以要用那些GC buffer或擴(kuò)增長(zhǎng)片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來(lái)擴(kuò)增，防止引進(jìn)新的突變。
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那種Quick change試劑盒分為幾種不同的類型。什么QuikChange? Site-Directed Mutagenesis Kit標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)突變?cè)噭┖?、QuikChange? XL Site-Directed Mutagenesis Kit長(zhǎng)模板單點(diǎn)突變?cè)噭┖校?gt;8kb）從原理上是一樣的，只是PCR的酶和BUFFER不一樣，后面用了比較適合長(zhǎng)片段擴(kuò)增的酶和BUFFER罷了，沒(méi)什么特別的東西。
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另外，DpnI處理的時(shí)間最好長(zhǎng)一點(diǎn)，最少一個(gè)小時(shí)吧，最好能有兩三個(gè)小時(shí)，因?yàn)槿绻０逄幚淼貌桓蓛?，哪怕只有那么一點(diǎn)點(diǎn)，模板直接在平板上長(zhǎng)出來(lái)，就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。
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實(shí)驗(yàn)板長(zhǎng)出來(lái)的菌有兩種可能：一種是質(zhì)粒DPNI沒(méi)處理干凈長(zhǎng)出來(lái)的（模板），一種是PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化出來(lái)的 （突變體）
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不過(guò)這兩種菌長(zhǎng)得一模一樣，即使提出質(zhì)粒來(lái)也是一樣（酶切和PCR都無(wú)法區(qū)分），除了測(cè)序，是分不出來(lái)的，做PCR時(shí)也最好做一個(gè)負(fù)對(duì)照（不加引物），實(shí)驗(yàn)管由于PCR時(shí)有引物，所以在DNPI處理前里面既含有模板又含有PCR產(chǎn)物，而對(duì)照管由于PCR時(shí)沒(méi)放引物，所以在DPNI處理前里面只有模板。
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如果兩者都拿去DNPI處理就能夠證明模板已經(jīng)被去除干凈。若實(shí)驗(yàn)順利的話應(yīng)該是：正對(duì)照長(zhǎng)菌負(fù)對(duì)照不長(zhǎng)菌。如果出現(xiàn)正負(fù)對(duì)照都長(zhǎng)菌，那么就是DpnI沒(méi)處理好，如果正負(fù)對(duì)照都不長(zhǎng)菌，那么有兩種可能，一種是PCR陰性，也就是說(shuō)PCR出問(wèn)題了，另外一個(gè)可能就是轉(zhuǎn)化出問(wèn)題了。要搞清楚是哪個(gè)問(wèn)題，跑膠說(shuō)明不了問(wèn)題，那就做個(gè)轉(zhuǎn)化的對(duì)照，拿試劑盒的對(duì)照實(shí)驗(yàn)去試感受態(tài)，馬上就能知道轉(zhuǎn)化有沒(méi)問(wèn)題。如果正對(duì)照很多菌，負(fù)對(duì)照有幾個(gè)菌，那么就是DPNI處理得不干凈，這個(gè)時(shí)候就得靠運(yùn)氣了。
