李靈軍組新型離子遷移質(zhì)譜揭示氨基酸手性對(duì)結(jié)構(gòu)影響
長(zhǎng)期以來，手性氨基酸都被認(rèn)為對(duì)淀粉樣蛋白（Amyloid beta peptide, Aβ）結(jié)構(gòu)和功能有調(diào)控作用。然而，這背后的分子機(jī)制并不是十分清晰。2019年11月6日，美國(guó)威斯康星大學(xué)麥迪遜分校李靈軍課題組（第一作者李功玉）在Nature Communications雜志上發(fā)表了一篇題為“Molecular Basis for Chirality-regulated Aβ Self-assembly and Receptor Recognition Revealed by Ion Mobility-Mass Spectrometry”的文章，通過新型離子遷移質(zhì)譜揭示了氨基酸手性對(duì)Aβ結(jié)構(gòu)的影響。
該文通過開發(fā)一整套基于新型離子遷移質(zhì)譜的快速手性分離分析平臺(tái)（作者將該方法命名為integrative chirality anatomy platform, iCAP），覆蓋了Aβ單體，多聚物和受體結(jié)合復(fù)合物的氨基酸手性效應(yīng)，重點(diǎn)克服了傳統(tǒng)離子遷移質(zhì)譜在結(jié)構(gòu)分辨率上的不足，實(shí)現(xiàn)不改儀器硬件的前提下提高超過十倍結(jié)構(gòu)分辨率，成功從手性混合物中分辨出單個(gè)氨基酸手性突變的Aβ立體異構(gòu)體，并揭示了不同氨基酸手性突變對(duì)其聚集傾向和受體結(jié)合的差異性影響，重點(diǎn)關(guān)注自然界常見手性突變的天冬氨酸（Asp）和絲氨酸（Ser）。該研究揭示了在未來針對(duì)老年癡呆癥的藥物開發(fā)時(shí)，手性突變的Aβ異構(gòu)體也應(yīng)該作為靶向研究不可忽略的一個(gè)方面，畢竟氨基酸的手性影響著Aβ的各方面物理化學(xué)性質(zhì)。
圖1. 快速手性分離分析平臺(tái)流程示意圖。
圖1顯示的是快速分離分析平臺(tái)的“三步驟”工作流程示意圖。第一步，針對(duì)手性突變的Aβ單體，作者提出用“金屬離子放大法”，即通過多肽-金屬離子相互作用依賴于多肽本身結(jié)構(gòu)的這個(gè)屬性，將多肽結(jié)構(gòu)的差異和多肽-金屬?gòu)?fù)合物的結(jié)構(gòu)差異結(jié)合起來分析（圖1a），以此來放大Aβ個(gè)別氨基酸手性突變引起的單體結(jié)構(gòu)差異性。第二步，通過繪制Aβ寡聚物生長(zhǎng)曲線的方式（圖1b），從分子量水平上可視化Aβ的聚集過程。進(jìn)一步計(jì)算每一個(gè)寡聚物的結(jié)構(gòu)差異，并提出一種全新的手性放大計(jì)算法（圖1d），從而實(shí)現(xiàn)從結(jié)構(gòu)變化的角度定量表征Aβ聚集過程中的手性效應(yīng)。第三步（圖1c），作者使用了近年來比較流行的蛋白質(zhì)氣相結(jié)構(gòu)分析工具，“碰撞誘導(dǎo)解折疊”（collision-induced unfolding, CIU），結(jié)合溶液相動(dòng)力學(xué)手段，系統(tǒng)表征了氨基酸手性在Aβ-受體相互作用過程中的影響。值得一提的是，作者本文所采用的是Aβ片段（包括N-端和C-端），這樣就可以在不受干擾的前提下，針對(duì)性研究手性對(duì)不同結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)影響程度。
多肽-金屬離子的結(jié)合是被廣泛認(rèn)可的會(huì)調(diào)節(jié)淀粉樣蛋白聚集的幾個(gè)重要因素之一。本文作者創(chuàng)造性地利用金屬離子結(jié)合依賴于多肽本身結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，基于手性突變的多肽在結(jié)構(gòu)上會(huì)有一些差異，因此金屬離子結(jié)合以后的復(fù)合物在結(jié)構(gòu)上應(yīng)該也會(huì)有所不同。如何將多肽本身的結(jié)構(gòu)差異和金屬離子結(jié)合的多肽復(fù)合物的結(jié)構(gòu)差異統(tǒng)一起來，以此實(shí)現(xiàn)手性差異放大，成為本文工作的一大亮點(diǎn)。作者對(duì)Aβ單體和其他神經(jīng)肽進(jìn)行了手性分析。在收集到apo-多肽、結(jié)合一個(gè)Cu的多肽復(fù)合物和結(jié)合兩個(gè)Cu的多肽復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息之后（CCS，collisional cross-section, 碰撞截面），作者依次將相關(guān)結(jié)果呈現(xiàn)在一維、二維和三維的坐標(biāo)軸上。當(dāng)只考慮apo-多肽的結(jié)構(gòu)信息時(shí)，手性分離的效果很差，很多情況下幾乎無法分開。這是由于這些多肽大都只有一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生手性突變，因此結(jié)構(gòu)改變也很小，一般的商業(yè)化的離子遷移質(zhì)譜無法將其分開。有趣的是，在二維分離坐標(biāo)中，作者發(fā)現(xiàn)原來?yè)頂D在一塊的D-和L-神經(jīng)肽被有效地拉開了，這是由于引入了一個(gè)Cu-結(jié)合的多肽復(fù)合物結(jié)構(gòu)信息，手性效應(yīng)由此被放大。這種手性放大效應(yīng)可以通過引入第三個(gè)坐標(biāo)，結(jié)合兩個(gè)Cu-的多肽復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息，進(jìn)一步被放大。
老年癡呆癥的一個(gè)典型特征是大腦中細(xì)胞周圍的淀粉樣斑塊沉積。一直以來，這種淀粉樣斑塊都被認(rèn)為與老年癡呆發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，雖然目前的機(jī)理尚不明確。因此，作者也針對(duì)性地開發(fā)了相關(guān)策略用于研究氨基酸手性突變對(duì)Aβ 聚集過程的影響。他們將該平臺(tái)應(yīng)用于Aβ 聚集過程中的氨基酸手性效應(yīng)研究。他們發(fā)現(xiàn)各種條件下的手性突變并不會(huì)大幅度改變生長(zhǎng)方式，即單個(gè)氨基酸手性突變不會(huì)顯著影響整條Aβ 聚集路徑。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)，雙氨基酸（Asp和Ser）共同突變會(huì)顯著降低最高的聚合度。作者進(jìn)一步利用多維手性放大計(jì)算法，結(jié)合該快速手性分離分析平臺(tái)，數(shù)據(jù)表明，手性突變對(duì)Aβ 聚合物的結(jié)構(gòu)改變程度遵循以下順序：雙氨基酸（Asp和Ser）共同突變 > 單點(diǎn)Asp突變 > 單點(diǎn)Ser突變。這一點(diǎn)上看，手性效應(yīng)在Aβ單體和寡聚物的結(jié)構(gòu)方面的影響是一致的。值得一提的是，這種手性效應(yīng)在混合野生型和突變型Aβ之后變得更加明顯，而這可能是更接近實(shí)際生物體系的情況，因?yàn)樵趯?shí)際條件下，兩者在很大概率情況下會(huì)共存。
然而，蛋白或者多肽一般不會(huì)獨(dú)自起作用。相反，絕大部分條件下，這些蛋白或多肽需要與周圍環(huán)境中的多種結(jié)合受體發(fā)生各種動(dòng)態(tài)的相互作用，以發(fā)揮他們的有效功能。因此作者最后還考察了氨基酸手性突變對(duì)其受體結(jié)合能力的影響。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，作者首先訴諸于快速的氣相結(jié)構(gòu)分析手段，CIU-IM-MS，即碰撞誘導(dǎo)去折疊離子遷移質(zhì)譜的方法（Collision-induced Unfolding-Ion Mobility-Mass Spectrometry）。該技術(shù)手段可以在消耗很少樣品的前提下，快速有效靈敏地揭示蛋白質(zhì)在氣相中的局部微小的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。其次作者還進(jìn)一步使用了溶液相動(dòng)力學(xué)手段SPR，即surface plasmon resonance ，表面等離子共振技術(shù)，檢測(cè)了手性突變對(duì)受體結(jié)合的動(dòng)力學(xué)差異。作者總結(jié)D-型突變顯著降低了受體結(jié)合的親和力以及對(duì)應(yīng)的結(jié)合速率?？偟膩碚f，C端Aβ片段和TTR（transthyretin, 甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）的結(jié)合都在微摩爾級(jí)別，相對(duì)比較弱。而作者進(jìn)一步對(duì)N端Aβ片段和HSA（human serum albumin, 人血清白蛋白）的結(jié)合進(jìn)行了手性分析。結(jié)果顯示，手性突變對(duì)N端Aβ-HSA 結(jié)合具有破壞性的作用而且其程度遵循以下順序：雙氨基酸（Asp和Ser）共同突變 > 單點(diǎn)Asp突變 > 單點(diǎn)Ser突變。綜合起來看會(huì)發(fā)現(xiàn)，手性效應(yīng)在Aβ單體、寡聚物結(jié)構(gòu)以及N端Aβ-HSA 結(jié)合方面的影響是一致的。然而，手性突變對(duì)C端Aβ-TTR 結(jié)合具有破壞性的作用卻遵循以下順序：?jiǎn)吸c(diǎn)Asp突變 > 單點(diǎn)Ser突變 > 雙氨基酸（Asp和Ser）共同突變。作者認(rèn)為這些結(jié)構(gòu)域依賴性的手性效應(yīng)應(yīng)該跟Aβ本身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相關(guān)，因?yàn)樗旧淼腘端和C端具有截然不同的晶體結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步對(duì)該假說進(jìn)行驗(yàn)證以及在完整序列的Aβ上研究手性突變的影響會(huì)使本文的發(fā)現(xiàn)更有實(shí)際意義。
主要作者介紹：
? 李靈軍，通訊作者，美國(guó)威斯康星大學(xué)麥迪遜分校藥學(xué)院教授，2000年于美國(guó)伊利諾伊大學(xué)香檳分校獲得化學(xué)博士學(xué)位, 之后在美國(guó)太平洋西北國(guó)家實(shí)驗(yàn)室和布蘭迪斯大學(xué)進(jìn)行博士后研究。2002年起在美國(guó)威斯康星大學(xué)麥迪遜分校任教?，F(xiàn)任威斯康星大學(xué)麥迪遜分校藥學(xué)院和化學(xué)系雙聘教授，獲威斯康星大學(xué)Charles Melbourne Johnson藥物科學(xué)與化學(xué)杰出講座教授和Vilas 杰出成就教授稱號(hào)。李靈軍教授長(zhǎng)期致力于生物分析科學(xué)以及質(zhì)譜相關(guān)技術(shù)的研究, 主要涉及的領(lǐng)域有神經(jīng)肽組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等, 并應(yīng)用這些尖端的分析方法和技術(shù)解決神經(jīng)生物學(xué)、基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)中的關(guān)鍵性問題。
? 李靈軍課題組（已畢業(yè)47位博士生，21位在讀博士生，6位博士后）在生物分析化學(xué)領(lǐng)域的貢獻(xiàn)主要在構(gòu)建基于高靈敏度質(zhì)譜多維分析平臺(tái), 并將此平臺(tái)應(yīng)用于新型神經(jīng)肽組學(xué)研究, 在高水平雜志上發(fā)表論文280多篇, 受邀學(xué)術(shù)報(bào)告200余場(chǎng)。李教授先后被授予分析化學(xué)個(gè)人成就獎(jiǎng)（匹茲堡會(huì)議）、美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金委生涯獎(jiǎng)、美國(guó)質(zhì)譜學(xué)會(huì)研究獎(jiǎng)、斯隆基金會(huì)研究獎(jiǎng), 以及2014 年Biemann Medal。2016年入選全球50位最有影響力女分析化學(xué)家。2019年 入選分析科學(xué)家Top 100 Power List (全球100位最有影響力的分析科學(xué)家)。李靈軍教授現(xiàn)任美國(guó)質(zhì)譜學(xué)會(huì)（JASMS）副主編和分析與生物分析化學(xué)（Analytical and Bioanalytical Chemistry）編委會(huì)成員。
? 李功玉，第一作者，現(xiàn)為美國(guó)威斯康星大學(xué)麥迪遜分校李靈軍教授課題組博士后，曾在中科大黃光明教授課題組攻讀博士學(xué)位期間（2012年 ?-2017年）開始接受質(zhì)譜的系統(tǒng)訓(xùn)練，并在2016年和2019年先后兩次訪問美國(guó)密歇根大學(xué)Brandon Ruotolo教授實(shí)驗(yàn)室學(xué)習(xí)離子遷移質(zhì)譜。自2017年8月加入李靈軍課題組以來，李博士的主要研究興趣包括開發(fā)基于離子遷移質(zhì)譜和敞開式大氣壓質(zhì)譜的原位蛋白質(zhì)質(zhì)譜新方法，用于解決人類疾病相關(guān)蛋白質(zhì)在復(fù)雜體系中的直接鑒定和快速結(jié)構(gòu)分析的技術(shù)難題及相關(guān)拓展應(yīng)用。李博士的相關(guān)工作已以其為第一作者身份發(fā)表了包括2篇Nature Communications（其中一篇被該雜志編輯入選為Featured Editors Highlights文章），3篇Analytical Chemistry和1篇Trends in Analytical Chemistry等在內(nèi)的多篇業(yè)內(nèi)高水平研究論文。鑒于其在原位蛋白質(zhì)質(zhì)譜領(lǐng)域的創(chuàng)新性研究成果，李博士于2019年被美國(guó)質(zhì)譜學(xué)會(huì)授予該年度博士后職業(yè)發(fā)展獎(jiǎng)（2019 ASMS Postdoctoral Career Development Award）以及入圍2019年度美國(guó)光譜分析化學(xué)學(xué)會(huì)年度創(chuàng)新獎(jiǎng)（2019 Federation of Analytical Chemistry and Spectroscopy Societies Innovation Award）。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-019-12346-8
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