液相色譜儀液體樣品預(yù)處理技術(shù)--固相萃取儀器結(jié)構(gòu)、操作
自1970年發(fā)明固相萃取技術(shù)以來(lái),其發(fā)展非常迅猛,出現(xiàn)了多種形式的萃取裝置,包括SPE柱(SPE?cartridge)、尖形SPE管(SPE?pipette?tip)、SPE盤(SPE disk)以及SPE板(SPE plate)等。
SPE柱(如圖1所示)的使用最為普遍,簡(jiǎn)單的SPE柱就是一根直徑為數(shù)毫米的小玻璃柱,或用聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯等塑料或不銹鋼制成的柱子。柱下端有一孔徑為20μm的燒結(jié)篩板,用以支撐吸附劑。在篩板上填裝一定量的吸附劑,然后在吸附劑上再加一塊篩板,以防止加樣品時(shí)破壞柱床?；趯?duì)純度的考慮,一般選用無(wú)添加劑且含有微量雜質(zhì)的醫(yī)用聚丙烯作為柱體材料,以免在萃取過(guò)程中污染試樣。為了降低SPE空白中的雜質(zhì),可選用玻璃、純聚四氟乙烯作為柱體材料。篩板材料是另一可能的雜質(zhì)來(lái)源,制作篩板的材料有聚丙烯、純聚四氟乙烯、不銹鋼和鈦等。金屬篩板不含有機(jī)雜質(zhì),但易受酸的腐蝕。由于柱體、篩板和填料都可能向試樣中引進(jìn)雜質(zhì),因此在建立和驗(yàn)證SPE方法時(shí),必須做空白萃取實(shí)驗(yàn)。
SPE的另一種形式是SPE盤(如圖2所示),外觀上與膜過(guò)濾器十分相似。盤式萃取器是含有填料的純聚四氟乙烯圓片,或載有填料的玻璃纖維片。填料占SPE盤總量的60%～90%,盤的厚度約1mm。SPE柱和盤式萃取器的主要區(qū)別在于床厚度與直徑之比,對(duì)于等重的填料,盤式萃取的截面積比柱式萃取大10倍左右,因而允許液體樣品以較高的流量流過(guò)。
當(dāng)所需處理的樣品量較大時(shí),如醫(yī)藥中間體的回收等,可采用板式SPE的固相萃取裝置。圖3給出了SPE板的結(jié)構(gòu),上下兩塊板上裝有多個(gè)SPE小柱,待處理的液體依靠重力、壓力、真空或離心力的作用通過(guò)萃取板,同時(shí)在收集板上進(jìn)行樣品的收集。典型的固相萃取一般分為以下五個(gè)基本步驟:
①根據(jù)檢測(cè)量的大小以及待檢物質(zhì)的化學(xué)、物理性質(zhì),選擇合適的吸附柱。
②活化填料。有利于吸附劑和目標(biāo)物質(zhì)相互作用,提高回收率。一般采用甲醇來(lái)活化,另外甲醇還能起到除雜的作用。每一活化溶劑的用量為(1～2)m/100mg固定相。
③進(jìn)樣。使樣品流經(jīng)吸附柱并被吸附。為了保留分析物,盡可能使用最弱的樣品溶劑,并允許采用大體積(0.5～1L)的上樣量。?
④沖洗。用水或者是適當(dāng)?shù)木彌_溶液對(duì)吸附柱進(jìn)行沖洗,將雜質(zhì)沖洗掉。通常沖洗溶劑體積為0.5～0.8ml/100mg固定相。⑤洗脫。選擇適當(dāng)?shù)南疵搫┻M(jìn)行洗脫,收集洗脫液,然后進(jìn)行濃縮、檢驗(yàn),或者是直接進(jìn)行在線檢測(cè)。洗脫溶劑用量一般為0.5～0.8ml/100mg固定相。
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圖1?SPE柱裝置示意圖
圖2 SPE盤
圖3 SPE板簡(jiǎn)圖
固相萃取(solid phase extraction,SPE)是一下種由柱色譜發(fā)展而來(lái)的樣品預(yù)處理技術(shù),所用的填料粒徑(>40μm)大于HPLC填料粒徑(3～10μm)。SPE與HPLC的差別是柱壓低、塔板數(shù)少、分離效率較低、一次性使用,因此只能分離保留性質(zhì)有很大差別的化合物。由于SPE實(shí)現(xiàn)了選擇性的提取、分離、濃縮三位一體的過(guò)程,操作時(shí)間短、樣品量小、干擾物質(zhì)少,因此可用于揮發(fā)性和非揮發(fā)性組分的預(yù)處理,并具有很好的重現(xiàn)性。
吸附劑是固相萃取的核心,吸附劑選用的好壞直接關(guān)系到能否實(shí)現(xiàn)萃取操作,以及萃取效率,同時(shí)新型吸附劑的研發(fā)也是固相萃取技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用的關(guān)鍵所在。早期的吸附劑多為活性炭、氧化鋁等強(qiáng)吸附性材料。常用的固相吸附材料有正相、反相和離子交換吸附劑三種正相吸附劑主要包括硅酸鎂、氨基、氰基、雙醇基硅膠、氧化鋁等,適用于極性化合物的萃取;反相吸附劑包括鍵合硅膠C18、鍵合硅膠C8、芳環(huán)氰基等,適用于非極性至一定極性化合物的萃取;離子交換吸附劑包括強(qiáng)陽(yáng)離子吸附劑(苯磺酸、丙磺酸、丁磺酸等)和強(qiáng)陰離子吸附劑(三甲基丙基胺、氨基、二乙基丙基胺等),適用于陰陽(yáng)離子型有機(jī)物的萃取。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)研制出多種復(fù)合型吸附劑。聚合二乙烯苯-N-乙烯吡咯烷酮及其鹽是一類性能獨(dú)特的反相吸附劑,獨(dú)有的親水和親脂性質(zhì)保持其在水中濕潤(rùn),能同時(shí)萃取極性物質(zhì)和非極性物質(zhì)。以氯甲基化的高分子樹脂PS-DVB(苯乙烯-聯(lián)苯乙烯共聚物)與二亞乙基三胺反應(yīng)制成的新型的陰離子交換聚合樹脂能同時(shí)萃取離子型和非離子型化合物;將碳化吸附劑與PS-DVB合用,能同時(shí)萃取強(qiáng)極性化合物和離子型化合物;將未封尾的C18硅膠與單官能團(tuán)的C18硅膠混合,可以擴(kuò)大C18柱的極性范圍。
免疫親和型吸附劑是基于抗體抗原相互作用的原理而研制出來(lái)的新型固相吸附劑。首先備一種專屬性的抗體,然后將其固定在瓊脂糖或硅膠上,當(dāng)樣品通過(guò)吸附床層時(shí)發(fā)生抗原-抗體結(jié)合,從而專屬性地將目標(biāo)組分分離出來(lái)。這種吸附劑是目前已知選擇性最強(qiáng)的固定吸附劑。近年來(lái),這種吸附劑越來(lái)越多地被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)以及環(huán)境分析等領(lǐng)域。分子印跡型吸附劑是一類新型的高選擇性吸附劑,能從復(fù)雜的生物基質(zhì)中選擇性地提取出微量分析物。表1中給出了常用的SPE固定相及應(yīng)用條件。
表1?SPE固定相及應(yīng)用條件
分離機(jī)制 | 典型固定相 | 被到物類型 | 裝載溶劑 | 洗脫溶劑 | |
正相 | 吸附 | 硅膠,氧化鋁,硅酸鎂 | 弱至中等極性 | 低P'(己烷,CHCI3) | 高P'(如甲醇,乙醇) |
極性鍵合相 | 氰基,氨基,二醇基 | 中等至強(qiáng)極性 | 低P(己烷,CHCI3) | 高P'(如甲醇,乙醇) | |
反相 | (非極性鍵合相)疏水性 | 十八烷基硅氧烷 八烷基硅氧烷 | 疏水性強(qiáng) (強(qiáng)非極性) | 高P'(如H2O,CH3OH/H2O,H3CN/H2O) | 低P'(已烷,CHCI3) |
疏水性中等 | 環(huán)己基,苯基,聯(lián)苯基 | 中等非極性 | 高P'(如H2O,CH3OH/H2O,H3CN/H2O) | 中等P'(如二氯甲烷,乙酸乙酯) | |
疏水弱 | 丁基,乙基,甲基 | 弱極性至中等非極性 | 高P'(如H2O)至中等P'(如乙酸乙酯) | 高P'(如乙腈,甲醇) | |
陰離子交換弱 | 氨基,1',2'氨基 | 離子(可電離),酸性 | 水或緩沖液(pH=pKa+2) | (A)緩沖液(pH=pKa-2) (B)使吸附劑與被測(cè)物pH為中性 (C)高離子強(qiáng)度的緩沖液? | |
陰離子交換強(qiáng) | 季銨 | 離子(可電離),酸性 | 水或緩沖液(pH=pKa+2) | (A)緩沖液(pH=pKa-2) (B)吸附劑與被測(cè)物pH為中性 (C)高離子強(qiáng)度的緩沖液? | |
陽(yáng)離子交換弱 | 羧酸 | 離子(可電離),堿性 | 水或緩沖液(pH=pKa-2) | (A)緩沖液(pH=pKa+2) (B)吸附劑與被測(cè)物pH為中性 (C)高離子強(qiáng)度的緩沖液? | |
陽(yáng)離子交換強(qiáng) | 烷基磺酸,芳磺酸 | 離子(可電離),堿性 | 水或緩沖液(pH=pKa-2) | (A)緩沖液(pH=pKa+2) (B)使被測(cè)物pH為中性 (C)高離子強(qiáng)度的緩沖液? |
在固相萃取中,選擇洗脫劑時(shí)首先應(yīng)考慮其對(duì)固定相的適應(yīng)性和對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的溶解度,其次是傳質(zhì)速率的快慢。洗脫正相吸附劑吸附的目標(biāo)組分時(shí),一般選用非極性有機(jī)溶劑(如正己烷、四氯化碳等);洗脫反相吸附劑吸附的目標(biāo)物質(zhì)時(shí),一般選用極性有機(jī)溶劑(如甲醇、乙腈、一氯甲烷等);對(duì)于離子交換吸附劑,常采用的洗脫劑是高離子強(qiáng)度的緩沖液。?
為了提高回收率,洗脫劑多選用小分子有機(jī)溶劑,同時(shí)增大洗脫劑用量。這樣可使吸附劑上的目標(biāo)組分盡可能地被洗脫下來(lái),但同時(shí)可能會(huì)引進(jìn)一些雜質(zhì),給分析帶來(lái)干擾。值得注意的是,以甲醇為洗脫劑洗脫樹脂時(shí),如果甲醇體積過(guò)大,則會(huì)引起樹脂的充分溶脹,目標(biāo)物質(zhì)深入到樹脂的內(nèi)部間隙,很難再被洗脫,導(dǎo)致洗脫不完全,回收率降低。
在固相萃取過(guò)程中,應(yīng)當(dāng)注意以下影響因素。?
①吸附劑的選擇:實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量選擇與目標(biāo)化合物極性相似的吸附劑,其用量大小與目標(biāo)物性質(zhì)(極性、揮發(fā)性)及其在水樣中的濃度直接相關(guān);吸附劑最好是多孔、比表面積大的固體顆粒,表面積越大,吸附能力越強(qiáng),但是相應(yīng)孔徑會(huì)減小,應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況綜合考慮;吸附劑必須具有較小的空白值,以減少吸附劑引起的污染和干擾;萃取吸附過(guò)程必須可逆并且具有較高的回收率,吸附劑必須能夠快速地吸附分析物,并且能夠在適當(dāng)?shù)娜軇l件下快速釋放分析物,同時(shí)具有恒定的回收率,保證整個(gè)分析結(jié)果更加可靠、準(zhǔn)確;吸附劑必須要具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性,具有較強(qiáng)的耐酸堿腐蝕能力,在各種淋洗劑條件下不會(huì)發(fā)生溶脹作用;吸附劑必須與樣品溶液表面有很好的界面接觸,只有樣品與吸附劑表面充分接觸才能夠保證定量萃取。
②溶劑的選擇:在固相萃取中,萃取固定相的活化、上樣富集、淋洗雜質(zhì)、分析物洗脫的過(guò)程中,都涉及溶劑的選擇問(wèn)題。溶劑選擇最重要的是溶劑強(qiáng)度,這是保證固相萃取成功的關(guān)鍵表2給出了常見(jiàn)正相型和反相型固相萃取中有機(jī)溶劑的極性和強(qiáng)度大小關(guān)系。
表2 正相型和反相型固相萃取中常用溶劑的性質(zhì)
極性 | 溶劑強(qiáng)度 | 溶劑 | 是否溶于水 | |
非極性
極性 | 強(qiáng)反相
? ? ? ? 弱反相? | 弱正相
強(qiáng)正相 | 正己烷 | 否 |
異辛烷 | 否 | |||
四鹵化碳 | 否 | |||
三鹵甲烷 | 否 | |||
二鹵甲烷 | 否 | |||
四氫呋喃 | 是 | |||
乙醚 | 否 | |||
乙酸乙酯 | 差 | |||
丙酮 | 是 | |||
乙腈 | 是 | |||
異丙醇 | 是 | |||
甲醇 | 是 | |||
水 | 是 | |||
乙酸 | 是 |
對(duì)于固定相活化溶劑,一般先使用強(qiáng)的溶劑去除固定相上的雜質(zhì),然后選擇與上樣溶劑強(qiáng)度一致的活化溶劑,以保證樣品能夠在固定相上充分保留。需注意的是,固定相在活化過(guò)程和活化結(jié)束后都要保持濕潤(rùn),否則會(huì)使固定相干裂或者進(jìn)入氣泡,導(dǎo)致柱效降低、回收率降低以及重現(xiàn)性變差。
對(duì)于上樣溶劑的選擇,要盡可能選擇弱強(qiáng)度的溶劑,保證樣品能夠充分地保留在固相萃取柱上,還可以采用大量上樣方法,提高富集倍數(shù)。如果上樣溶劑強(qiáng)度過(guò)高,樣品不能保留或者弱保留,則回收率低。
對(duì)于洗脫溶劑,要選擇溶劑強(qiáng)度比較大的,保證保留在固定相上的樣品洗脫下來(lái),對(duì)大多數(shù)化合物來(lái)說(shuō),乙腈是一種比甲醇和乙醇更好的洗脫溶劑。另外,選擇的洗脫溶劑要與后續(xù)的分析條件相適應(yīng)。還有就是要選擇黏度小、純度高、毒性小并且不與樣品和固定相發(fā)生反應(yīng)以及不會(huì)干擾樣品后續(xù)檢測(cè)的溶劑。如果單一的洗脫溶劑效果不理想,也可考慮使用混合溶劑進(jìn)行洗脫。
③固定相容量:在上樣過(guò)程中,要注意樣品的含量不要超過(guò)萃取柱容量,如果超過(guò)萃取柱容量,過(guò)量的樣品不會(huì)在萃取柱上保留而丟失,導(dǎo)致回收率下降。
④流速控制:流速的控制對(duì)固相萃取至關(guān)重要,流速過(guò)大將引起萃取柱的穿漏,流速小則處理速度太慢。萃取柱預(yù)處理過(guò)程中流速適中,保證溶液充分濕潤(rùn)吸附劑即可,上樣和洗脫過(guò)程則要求流速盡量慢些,以使分析物盡量保留在柱內(nèi)或達(dá)完全洗脫,否則會(huì)導(dǎo)致分析物流失,影響回收率的大小。尤其是離子交換過(guò)程進(jìn)行比較緩慢,應(yīng)采用較低的流速(0.5～2.0ml/min)。
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會(huì)議會(huì)展
