Isotype胞內(nèi)染色有哪些學(xué)問？來看看這篇文章怎么說
對科研黨來說，流式細(xì)胞術(shù)一點(diǎn)都不陌生，它以自己特有的方式從細(xì)胞蛋白水平定量檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)，并且能get到目標(biāo)蛋白在各個(gè)細(xì)胞亞群中的表達(dá)，同時(shí)在細(xì)胞功能上也有很重要的作用，包括細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖等等。
流式細(xì)胞術(shù)以細(xì)胞為研究對象，在流式細(xì)胞儀的作用下定量檢測樣品細(xì)胞的物理化學(xué)特征，其定量是以光信號為基礎(chǔ)的，通過分析接收到的激光照射到細(xì)胞后的散射光信號和熒光信號完成定量分析。散射光信號是激光照射到細(xì)胞后散射形成的，散射光的波長與激光的波長相同；熒光信號是細(xì)胞上結(jié)合的熒光素被激光激發(fā)后產(chǎn)生的，一般熒光信號的波長要長于激發(fā)它的激光的波長，流式細(xì)胞儀通過光路系統(tǒng)將熒光信號根據(jù)波長的不同分成不同的部分，不同波長的熒光分別進(jìn)入各自的接收器被流式細(xì)胞儀接收和分析。
在大部分流式表面染色的實(shí)驗(yàn)中，不需要特定緩沖液來支持，同時(shí)在表面染色中的陰性對照通常是不染色的 blank 和同型對照 isotype。所以針對表面 marker 的流式實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)會顯得比較容易。在此基礎(chǔ)上，如果您的實(shí)驗(yàn)中需要用流式細(xì)胞術(shù)來探索胞內(nèi)的指標(biāo)，您還需要考慮其他的一些因素。
1選擇合適的濃度
在細(xì)胞表面染色的實(shí)驗(yàn)中，抗體的合適濃度是十分重要。一樣地，在胞內(nèi)染色實(shí)驗(yàn)中依然是十分關(guān)鍵?？贵w的推薦溶度可以在我們官網(wǎng)的 Technical Data Sheet 上的推薦濃度部分中找到，如下圖所示：
BioLegend 提供的推薦濃度都是經(jīng)過 3-5 點(diǎn)的滴定，從中選擇了一個(gè)最好的信噪比的濃度作為推薦濃度。
雖然推薦濃度是經(jīng)過我們廠內(nèi)驗(yàn)證，但是由于您的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，條件和樣品的不同，您還需要進(jìn)行抗體滴定來確認(rèn)最適合您的實(shí)驗(yàn)體系的抗體濃度。如果在實(shí)驗(yàn)中使用的抗體不足，您可能檢測不到目的群體，或者目的群體的分群不夠理想。然而，倘若您在實(shí)驗(yàn)中使用了過量的抗體，很可能會出現(xiàn)所有細(xì)胞群體的背景信號增加，這樣在數(shù)據(jù)分析的時(shí)候就會出現(xiàn)偏差，這種現(xiàn)象常稱之為“胞內(nèi)漂移”（intracellular shift）。
2選擇合適的緩沖液
如果需要檢測胞內(nèi)指標(biāo)，就需要先對細(xì)胞進(jìn)行固定（fixation），然后將細(xì)胞進(jìn)行透化（permeabilization）。最常見的固定劑是多聚甲醛溶液（paraformaldehyde， PFA），它能穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)果，之后通過去垢劑或者酒精再對細(xì)胞進(jìn)行透化處理。細(xì)胞經(jīng)過透化處理之后，抗體就可以直接進(jìn)去入細(xì)胞內(nèi)部去結(jié)合胞內(nèi)的目標(biāo)蛋白。目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，會決定最適合于實(shí)驗(yàn)的緩沖液。
胞漿內(nèi)蛋白
對于胞漿內(nèi)蛋白的染色，比如細(xì)胞因子，通常需要進(jìn)行兩步法的固定和透化處理，BioLegend 提供了兩種適用的 buffer 套裝可供選擇：
a）Fixation Buffer 和 Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10X)。
b）新發(fā)布的 Cyto-Fast? Fix/Perm Buffer Set。
如上所見，第一個(gè)選項(xiàng)中 fixation buffer 和 intracellular staining Permeabilization wash buffer 是獨(dú)立包裝的兩個(gè)產(chǎn)品，而新發(fā)布的 Cyto-Fast? Fix/Perm Buffer Set 是包含了 fix/perm buffer 和 perm wash buffer 的套裝，并且套裝是一并經(jīng)過 QC 質(zhì)控，相比于傳統(tǒng)的 fixation buffer 和 Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10X)，Cyto-Fast? Fix/Perm Buffer Set 在信噪比上的表現(xiàn)更好。這樣的話，可以提供更穩(wěn)定及可重復(fù)的結(jié)果。
下圖為分別使用了 fixation buffer/intracellular staining Permeabilization wash buffer 和 Cyto-Fast? Fix/Perm Buffer Set 在極化的人 Th1 細(xì)胞的胞內(nèi)染色結(jié)果：
核內(nèi)蛋白
如果您的研究是研究核內(nèi)的指標(biāo)，比如轉(zhuǎn)錄因子，不僅僅需要緩沖液透化外部的細(xì)胞膜，還需要透化細(xì)胞核核膜，使得抗體可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合核內(nèi)蛋白。為了做好核內(nèi)蛋白的染色，我們推薦使用 True-Nuclear? Transcription Buffer Set 來作為實(shí)驗(yàn)緩沖液。這是我們 FOXP3 Fix/Perm Buffer Set 的升級版。某些核膜透化的buffer會影響串聯(lián)染料的表現(xiàn)，增加溢漏到串聯(lián)染料的 donor 通道的熒光補(bǔ)償。
人全血使用APC/Cy7 CD3抗體（藍(lán)色和紅色柱狀圖）或APC/Fire? 750（綠色和紫色的柱狀圖）染色，然后進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，清洗之后再按以下條件進(jìn)行固定：A、使用FOXP3 Fix/Perm Buffer固定后用FOXP3 Perm Buffer進(jìn)行透化（紫色和紅色）；B、使用True-Nuclear? Fix Buffer固定，再用True-Nuclear? Perm Buffer透化（綠色和藍(lán)色）。
從上圖中可以看到，使用 FOXP3 buffer 套裝時(shí)，APC/Fire? 及 APC/Cy7 溢漏到 APC 通道的補(bǔ)償值明顯大于 True-Nuclear? Transcription Buffer Set.
磷酸化蛋白
當(dāng)我們使用磷酸化特異性的抗體分析細(xì)胞內(nèi)的蛋白磷酸化水平時(shí)，就需要能夠比胞漿內(nèi)染色及核內(nèi)染色更強(qiáng)力的固定破膜劑。在做磷酸化蛋白的染色時(shí)，推薦使用基于甲醇的，專門為磷酸化蛋白染色優(yōu)化的 True-Phos? Perm Buffer。
上圖中是人全血使用（右圖）或不使用（左圖）IL-6刺激15分鐘之后，使用RBC/Lysis Fixation Solution 進(jìn)行裂紅處理，然后使用True-Phos? Perm Buffer進(jìn)行透化，之后使用CD3 APC和 STAT3 pY705（clone 13A3-1）FITC進(jìn)行染色。
由于 True-Phos? Perm Buffer 含有甲醇，在使用時(shí)需要注意用于表面染色的抗體是否適用于含有甲醇的緩沖液。甲醇有時(shí)會改變甚至破壞抗體識別的表位。所以，在正式實(shí)驗(yàn)之前，需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)或者文獻(xiàn)來確定表面染色所用的抗體是否適用于甲醇固定的樣品，BioLegend 的網(wǎng)頁 fixation page 中，提供了我們廠內(nèi)測試的一些克隆號在 4% PFA 固定之后的表現(xiàn)，雖然它們不是甲醇固定，但是依然是您參考的一個(gè)方向。如果您選用的抗體克隆不適用于甲醇，那可以嘗試在固定之前對表面指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記，不過需要注意的是選用甲醇不敏感的熒光素，如下表所示：
“特殊照顧對象”
凡事皆有例外，盡管我們提供了多種 buffer 來匹配相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，但是不得不承認(rèn)，依然有某些克隆的抗體，我們還未優(yōu)化好相應(yīng)的 buffer，比如 Ki-67 的 16A8 克隆號的抗體。不過，16A8 可以使用 70% 冰乙醇作為固定破膜劑，詳細(xì)的使用請見相應(yīng)的產(chǎn)品說明書。
3選擇合適的對照
何為陰性何為陽性？選擇合適的對照就顯得格外重要。我們的官網(wǎng)中介紹了流式實(shí)驗(yàn)中的常見對照組：https://www.biolegend.com/flow_controls
同型對照-isotype control
假如您的實(shí)驗(yàn)只涉及了細(xì)胞表面的染色，同型對照就是一個(gè)理想的對照組。但是在胞內(nèi)染色時(shí)，只有同型對照，還不足以準(zhǔn)確地進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在做胞內(nèi)染色的流式實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們時(shí)常發(fā)現(xiàn)整個(gè)細(xì)胞群體都發(fā)生了漂移，這樣就會在數(shù)據(jù)分析的時(shí)候誤導(dǎo)我們，難以判斷什么才是真正的陽性細(xì)胞群體。所以在胞內(nèi)染色實(shí)驗(yàn)時(shí)，isotype 只能作為一個(gè)參考，但是不能作為最終劃門的標(biāo)準(zhǔn)，尤其在那類陰陽性細(xì)胞有明顯的界限的情況下。如下圖所示，假如您是按照 isotype 的 MFI 值來劃定十字門（黑色實(shí)線），您會在 Q1 和 Q2 門里發(fā)現(xiàn)，陽性細(xì)胞的比例變高了。如果按照陰性和陽性的分界線來劃門（紅色實(shí)線），您獲得的數(shù)據(jù)就會更加準(zhǔn)確。
生物學(xué)對照
當(dāng)做胞內(nèi)細(xì)胞因子或者信號通路分子的胞內(nèi)染色時(shí)，選用生物學(xué)對照作為劃門的標(biāo)準(zhǔn)是個(gè)不錯(cuò)的選擇。比如說，您的樣品細(xì)胞是 PMA/Inomycin、LPS 或者 CD3/CD28 刺激的細(xì)胞，您也應(yīng)該同時(shí)準(zhǔn)備相同類型的細(xì)胞，但是不給予相應(yīng)的刺激。這樣才能區(qū)分出刺激前后，目的蛋白的本底表達(dá)水平和接受刺激之后細(xì)胞應(yīng)答所產(chǎn)生的表達(dá)變化。
人外周血極化得到的Th2細(xì)胞僅使用monensin處理（上左圖）或使用monensin及PMA、Ionomycin處理三小時(shí)后（上右圖）使用CD3（x軸）表面染色和GM-CSF（Y軸）胞內(nèi)染色結(jié)果。
熒光減一對照（FMO）
除了以上的對照組外，還有一個(gè)重要的對照，即熒光減一對照。顧名思義，F(xiàn)MO 指的是使用的熒光為您樣品所有染色指標(biāo)減少一個(gè)指標(biāo)的對照。這一對照不僅可以幫助您界定弱表達(dá)指標(biāo)的陰陽性，還可以在多指標(biāo)的 panel 中幫您從熒光溢漏的信號中區(qū)分出陰性群和陽性群。
希望通過本文，可以幫助您理解胞內(nèi)染色實(shí)驗(yàn)中的一些注意事項(xiàng)，比如確定合適的抗體濃度、buffer 以及合適的對照。最后，愿各位研究者能夠獲取一致并且可信的數(shù)據(jù)。
