液相色譜儀液體樣品預(yù)處理技術(shù)--樣品預(yù)處理技術(shù)概述
色譜分析的全過程主要包括四個(gè)步驟:樣品的采集、樣品的制備、色譜分析及數(shù)據(jù)處理與結(jié)果的表達(dá)。樣品采集包括取樣點(diǎn)的選擇和樣品的收集、樣品的運(yùn)輸和儲存;樣品制備包括將樣品中欲測組分與樣品基體和干擾組分分離、富集及轉(zhuǎn)化成色譜儀器可分析的形態(tài)等操作。色譜分析樣品的采集和制備是一個(gè)非常重要且復(fù)雜的過程,通常將色譜樣品的采集和樣品的制備統(tǒng)稱為色譜分析樣品預(yù)處理技術(shù)。
樣品預(yù)處理作為色譜分析的重要步驟,建立簡單、快速、有效的樣品預(yù)處理方式以使復(fù)雜樣品的色譜分析獲得較低的檢測背景,同時(shí)能獲得較高靈敏度是色譜分析工作者一直都在追求的目標(biāo)。由于色譜分析技術(shù)涉及樣品的種類繁多、組成及其濃度復(fù)雜多變、物理形態(tài)范圍廣泛,直接進(jìn)行分析測定構(gòu)成的干擾因素特別多,通常需要對樣品做一些必要的預(yù)處理。
現(xiàn)代色譜儀器對樣品分析所用的時(shí)間越來越短,但是樣品的制備過程所用時(shí)間卻仍然很長。統(tǒng)計(jì)表明,大部分色譜分析實(shí)驗(yàn)室中用于色譜分析樣品制備過程的時(shí)間約占整個(gè)分析時(shí)間的2/3,而只有10%的時(shí)間用于色譜分析,其余時(shí)間用于分析測定結(jié)果的整理和輸出報(bào)告等。對提高工作效率而言,改善和優(yōu)化色譜分析樣品制備的方法和技術(shù)是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。
液相色譜對樣品的要求是液體或者是可溶解在某些溶劑中的固體,通常是不揮發(fā)或難揮發(fā)的樣品,而且其中不能含有微小的顆粒物以免色譜柱發(fā)生堵塞。此外,在使用色譜技術(shù)進(jìn)行樣品分析時(shí),常常會遇到采集的原始樣品不適合于直接進(jìn)行色譜分析的要求,樣品中目標(biāo)組分的含量很低,特別是原始樣品基體干擾大的情況,諸如樣品是黏滯的流體、膠體溶液或者固體等,這使得色譜分析的樣品制備方法及其技術(shù)在現(xiàn)代色譜分析中越來越重要。
迄今為止,除用于已知樣品組成與測定范圍的流程色譜儀外,色譜儀器還不能做到在現(xiàn)場環(huán)境直接收集樣品并自動(dòng)完成樣品的選擇、分離和測定等步驟,一般需要離線進(jìn)行樣品的采集和處理。
因而,樣品預(yù)處理要比HPLC分離與數(shù)據(jù)分析花費(fèi)更多的時(shí)間樣品預(yù)處理可能是HPLC方法建立中最具挑戰(zhàn)性的一個(gè)環(huán)節(jié)。樣品預(yù)處理開始于樣品的采集,一直到樣品注入HPLC、上柱,其中包括多步操作,見表1的總結(jié)。HPLC分析的精密性與準(zhǔn)確度往往決定于樣品的預(yù)處理步驟,可見,必須認(rèn)真對待、仔細(xì)設(shè)計(jì)樣品的預(yù)處理過程。表2也依據(jù)樣品的形態(tài)對樣品的預(yù)處理方法進(jìn)行了系統(tǒng)的分類。
表1?樣品預(yù)處理的選擇
選擇 | 評述 |
(1)樣品的收集 | 用符合統(tǒng)計(jì)學(xué)的程序獲得有代表性的樣品 |
(2)樣品的儲藏與保存 | 用適的惰性、密封容器;特別小心易揮發(fā)、不穩(wěn)定或活性的物質(zhì);如必要,穩(wěn)定樣品;生物樣品可能需要冷凍 |
(3)樣品的初加工 | 樣品形式必須適于有效的樣品預(yù)處理(如干燥、過篩、碾細(xì)等);細(xì)小的離散樣品易于溶解或提取 |
(4)稱重或定容稀釋 | 有必要注意活活性,不穩(wěn)定或生物物質(zhì);稀釋時(shí),用經(jīng)校正的容量器皿 |
(5)其他的樣品加工方法 | 溶劑替換、除鹽、蒸發(fā)、冷凍干燥等 |
(6)除去微粒 | 濾過、固相萃取、離心 |
(7)樣品的提取 | 液體樣品方法,固體樣品方法 |
(8)衍生化 | 主要用于增強(qiáng)被測物的檢測精度;有時(shí)也用于改善分離 |
表2?樣品預(yù)處理方法
樣品類型 | 樣品預(yù)處理的方法 | 技術(shù)原理 | 評述 |
液體 | 固相萃取 | 液體流過能選擇性地捕集被測物(或干擾物)的固定相;捕集的被測物可用強(qiáng)溶劑洗脫下來;有時(shí),保留干擾物而允許被測物通過固定相,不被保留;機(jī)制同HPLC | 用于選擇性捕集所需無機(jī)、有機(jī)和生被測物的固定相有很多種;也有用于藥物、烴類、兒茶酚胺和許多其他種類的化合物、痕量水富集的特殊固定相 |
液-液萃取 | 樣品在兩種不混溶的液相中分配,應(yīng)選溶解性差異較大的液相 | 注意勿形成乳液—加熱、加鹽可使之壞;用不同溶劑或影響化學(xué)平衡的添加劑(如緩沖劑調(diào)節(jié)pH值、鹽改變離子強(qiáng)度試劑、離子對試劑等)改變KD值;有許多連續(xù)提取低KD或大體積樣品的報(bào)道 | |
稀釋 | 用與HPLC流動(dòng)相相溶的溶劑稀釋樣品,避免色譜柱超載,或使其濃度在檢測器線性范圍內(nèi) | 為避免譜峰擴(kuò)展,溶劑應(yīng)于HPLC流動(dòng)相中混溶;“稀釋即可進(jìn)樣”是簡單的液體樣品如藥物制劑的一般樣品制備方法 | |
蒸發(fā) | 在大氣壓下緩緩加熱除去液體,可通過氣流、惰性氣體或真空輔助操作進(jìn)行 | 蒸發(fā)勿過快;暴沸會損失樣品;注意樣品在容器壁上的損失;勿過熱蒸干;在惰性氣體下蒸發(fā)較好,如N2;最好使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;已有自動(dòng)系統(tǒng)(如Turbovap)可用 | |
蒸餾 | 加熱樣品至溶劑的沸點(diǎn),揮發(fā)性被測物在蒸氣相中濃縮、冷凝和收集 | 主要用于易揮發(fā)的樣品;如加熱溫度太高,樣品會分解;低蒸氣壓化合物可用真空蒸餾;蒸汽蒸餾最高溫度為100℃,相當(dāng)溫和 | |
微滲析 | 在兩種水溶液之間置一片半透膜,樣品溶質(zhì)依其濃度差,從一溶液轉(zhuǎn)移至另一溶液中 | 滲析物需用富集技術(shù)濃縮,如SPE;微滲析用于檢測活性動(dòng)植物組織和發(fā)酵液中細(xì)胞外的化學(xué)物質(zhì);已與微LC柱在線聯(lián)用;由于高分子量蛋白不能通過濾膜,用分子量截止膜的滲析也能在線用于HPLC樣品的脫蛋白;同樣可用超濾與反滲析法 | |
冷凍干燥 | 冷凍水溶液樣品,真空下水分被升華除去 | 有利于非揮發(fā)性有機(jī)物;可處理大體積樣品;可能損失揮發(fā)性被測物;能濃縮無機(jī)物 | |
混懸液 | 過濾 | 液體通過濾紙或?yàn)V膜,濾除懸浮顆粒 | 極力推薦該法以排除反壓問題,延長色譜柱壽命;濾膜必須與溶劑相兼容,使其在實(shí)驗(yàn)中不致溶解:大孔徑(>2μm)濾器可提高流速,小孔徑濾器(<0.2μm)可除去細(xì)菌 |
離心 | 樣品放于錐形離心管中,以高速旋轉(zhuǎn);傾出上清液 | 有時(shí)從離心管中取出定量固體樣品較沉降難;超速離心一般不用于去除簡單微粒 | |
沉降 | 在沉降容器中靜止放置,使樣品沉淀;沉降速率取決于Stoke半徑 | 為一極慢過程;依照沉淀速率,可在不同水平下人工回收不同粒徑的微粒 | |
固體 | 固-液萃取 | 樣品置于具塞容器內(nèi),加入溶劑溶解被測物;從固體中濾出溶液(有時(shí)亦稱“振搖/過濾”法) | 有時(shí)可煮沸或回流溶劑以提高溶解度;細(xì)小分散狀態(tài)的樣品易于浸出;樣品可用人工或自動(dòng)振搖;經(jīng)過濾、傾析或離心等操作,從不溶性固體中分離出樣品 |
索氏提取 | 樣品可用樣品置于活動(dòng)的多孔容器(套管)中;回流溶劑連續(xù)流過該套管,溶解被測物,連續(xù)收集到蒸餾瓶中 | 以純?nèi)軇┨崛?樣品在溶劑的沸點(diǎn)處必須穩(wěn)定;緩慢,但提取直至完成不需有人照看;價(jià)低對自由流動(dòng)粉末最好;回收率很好(可用于其他固相萃取法的參照標(biāo)準(zhǔn)) | |
強(qiáng)制流動(dòng) 浸出 | 樣品置于流通管中,并使溶劑從中流過;加熱流通管至溶劑的沸點(diǎn)附近 | 適于顆粒性樣品;溶劑能用高壓N2注入或推過;所需溶劑體積小于索氏提取;結(jié)果相似,速度更快 | |
均勻化 | 樣品置于混合器中,加入溶劑,使樣品均一化成細(xì)小離散狀態(tài);除去溶劑,進(jìn)一步混勻 | 用于動(dòng)植物組織、食品、環(huán)保樣品;可用有機(jī)及水溶劑;可加于冰或硅藻土增大樣品的流動(dòng)性;對小分散樣品的萃取效率較高 | |
超聲 | 細(xì)小的分散樣品浸沒于裝有溶劑的超聲容器中,進(jìn)行超聲輻射。也可用超聲探頭或杯型超聲破碎器進(jìn)行操作 | 用超聲作用輔助溶解;可加熱提高萃取速率;安全、快速;最適于粗糙、顆粒狀物質(zhì);可同時(shí)處理多份樣品;與溶劑的接觸效率高 | |
溶解 | 用強(qiáng)溶劑直接溶解試樣,使被測物溶入溶液,避免發(fā)生化學(xué)反應(yīng) | 無機(jī)固體可能需加酸或堿達(dá)到完全溶解;有機(jī)樣品往往能直接溶于溶劑中;溶解后,可能需要過濾 | |
加速溶劑萃取(ASE) | 樣品置于密封容器中,加熱至沸點(diǎn)以上,使容器中的壓力上升;自動(dòng)取出萃取樣品,并轉(zhuǎn)移至小瓶中作進(jìn)一步處理 | 可大大加快液-固萃取過程;自動(dòng)化;容器必須能耐高壓;萃取的樣品較稀,需進(jìn)一步濃縮;由于使用高壓、高溫溶劑,需有安全措施 | |
自動(dòng)索氏 提取 | 熱溶劑浸出與索氏提取的結(jié)合;套管中的樣品先浸沒在沸騰溶劑中,然后升溫,進(jìn)行常規(guī)索氏提取/用回流溶劑淋洗,最后濃縮 | 人工與自動(dòng)操作均可;所需溶劑量少于傳統(tǒng)索氏法;溶劑可回收利用;由于二步操作,可減少提取時(shí)間 | |
超臨界流體 提取 | 樣品置于流通容器中,超臨界流體(如CO2)流過樣品;降低壓力后,提取的樣品收集在溶劑中或捕集到吸附劑上,然后再以溶劑淋洗解吸附 | 人工與自動(dòng)操作均可;可采用改變超臨界流體密度或加入改性劑的方法,改變超臨界流體的極性;收集的樣品通常較濃因?yàn)镃O2在提取結(jié)束后即被除去,因此相對無污染;基質(zhì)影響提取過程;方法建立的時(shí)間可能比其他現(xiàn)代方法長 | |
微波輔助 提取 | 樣品置于開口或密閉的容器中,以微波能量加熱,使被測物被提取到溶劑中 | 提取溶劑可分為吸收微波溶劑(MA)和不吸收微波溶劑(NMA)兩種;采用MA樣品置于高壓容器中,如加速溶劑萃取(ASE),充分加熱至沸點(diǎn)以上;采用NMA時(shí),容器可開口操作,無壓力升高現(xiàn)象;微波箱中用有機(jī)溶劑(MA或NMA)與MA在高壓操作時(shí),需有安全操作規(guī)程 | |
熱提取 | 采用動(dòng)力學(xué)頂空進(jìn)樣形式,但加熱提取加熱樣品至很高(可控制)的溫度,可高達(dá)350℃? | 系統(tǒng)必須由熔融石英或熔融硅膠制造,使提取的被測物不至于與熱金屬表面發(fā)生反應(yīng);應(yīng)避免系統(tǒng)局部過冷;適用于蒸氣壓較低的樣品 |
到目前為止,還沒有一種通用的樣品預(yù)處理方法能夠適合于所有樣品或者所有待測對象。即使是同一個(gè)待測物,由于所處的樣品環(huán)境和條件不同,可能需要采用的預(yù)處理方法也不同。所以對不同樣品中的分析對象要具體分析,選擇最佳預(yù)處理方案。而判斷所選擇的樣晶預(yù)處理方法是否合理,一般情況下需要遵循以下原則。
①是否能夠最大限度去除影響測定的其他干擾物。這是衡量預(yù)處理方法是否有效的要指標(biāo),否則即使方法簡單、快速也不能選擇該方法。
②被測組分的回收率是否高?；厥章什桓咄ǔ０殡S著測定結(jié)果的重復(fù)性較差,不但影響法的靈敏度和準(zhǔn)確度,而且最終使低濃度樣品無法測定,因?yàn)闈舛仍降?回收率往往也越差。
③操作是否簡便、省時(shí)。預(yù)處理方法步驟越多,多次轉(zhuǎn)移引起的樣品損失就越大,最樣終的誤差也越大。
④成本是否低廉,盡量避免使用昂貴的儀器與試劑。
⑤是否影響人體健康及環(huán)境。應(yīng)該盡量少用或者不用污染環(huán)境或影響人體健康的試劑,即使不可避免,必須使用時(shí)也要回收循環(huán)利用,將其危害降低到最低限度。
⑥應(yīng)用范圍盡可能廣泛。盡量適合各種分析測試方法,甚至聯(lián)機(jī)操作,便于過程自動(dòng)化。
⑦是否適用于野外或現(xiàn)場操作。 ?
