STTT | 重磅綜述-癌癥代謝研究利器

麥特繪譜

2023.6.21

腫瘤細(xì)胞在重編程代謝方面具有極高的靈活性，以推動腫瘤的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移和對治療的抵抗。這些重編程的活動包括對細(xì)胞生物能、生物合成和氧化還原狀態(tài)的全面重構(gòu)，以滿足細(xì)胞的能量需求增加。代謝組學(xué)和代謝流組學(xué)（fluxomics）是主要革命性技術(shù)方法，使研究人員能夠?qū)Π┌Y中的生化活動進行定性檢測和機制分析。此外，從大規(guī)模分析轉(zhuǎn)向單細(xì)胞分析技術(shù)提供了前所未有的機會：對癌癥生物學(xué)指標(biāo)進行深入的定量分析，實現(xiàn)對復(fù)雜和異質(zhì)性疾病的研究。

近期，功能基因組篩選的出現(xiàn)使得識別分子通路、細(xì)胞過程、生物標(biāo)志物和新的治療靶點成為可能，這與其他技術(shù)結(jié)合起來可以實現(xiàn)患者分層和治療方案的個性化。本綜述旨在為研究人員提供癌癥代謝方面的指南，突出當(dāng)前的新興技術(shù)，強調(diào)其優(yōu)點、缺點和應(yīng)用，并有潛力推動創(chuàng)新抗癌治療的發(fā)展。

癌癥代謝的研究進展

1910年，Joseph J. Thomson首次測量了分子的質(zhì)譜圖。1931年，Otto H. Warburg因為對呼吸酶的表征而獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。1938年，Isidor I. Rabi首次在氯化鋰束流中檢測到核磁共振（NMR），從而發(fā)展了該方法，并在1946年由Felix Bloch和Edward M. Purcell擴展到液體和固體。氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）于1959年出現(xiàn)，液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）于1974年引入。癌基因和腫瘤抑制基因的發(fā)現(xiàn)可以追溯到20世紀(jì)80年代。1994年，Tsutomu Nomizu和他的同事首次實現(xiàn)了單細(xì)胞質(zhì)譜實驗檢測，而在1998年，Steven Oliver首次引入了代謝組學(xué)的概念。2004年出現(xiàn)了下一代測序（NGS）技術(shù)，2007年誕生了飛行時間細(xì)胞流式細(xì)胞儀（CyTOF）的首個原型和人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB）的第一個版本。2009年發(fā)展出了單細(xì)胞RNA測序（scRNAseq），2016年發(fā)展出了單細(xì)胞代謝組學(xué)（SCM），2017年發(fā)展出了空間代謝組學(xué)。2014年進行了首次全基因組功能篩選，2020年Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna因發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)而獲得諾貝爾化學(xué)獎。2020年，基于流式細(xì)胞術(shù)的Met-flow和SCENITH技術(shù)被提出。2022年，Douglas Hanahan最終將細(xì)胞代謝的失調(diào)認(rèn)定為癌癥的核心特征。

圖1. 癌癥代謝研究的重要事件時間線

代謝組學(xué)：癌癥研究和治療的強大工具

代謝組學(xué)是對小分子代謝物的高通量研究，包括細(xì)胞、生物體液、組織等基質(zhì)中具有不同生理化學(xué)特征和動態(tài)豐度范圍的所有小分子(50?1500Da)，通常稱為代謝物。鑒定與其他組學(xué)檢測不同，代謝物及其濃度直接代表分子表型。代謝組學(xué)用于癌癥研究，以有效檢測生物樣品中其水平受腫瘤進展影響的代謝物，具有廣泛的應(yīng)用，如生物標(biāo)志物篩選鑒定、藥物發(fā)現(xiàn)或開發(fā)、臨床毒理學(xué)、營養(yǎng)研究和定量表型分析。

代謝組學(xué)有兩種檢測策略：靶向或非靶向分析。靶向（或基于驗證）代謝組學(xué)方法的目標(biāo)是識別和量化相對較少（＜100）的已知分析物，而非靶向（或基于發(fā)現(xiàn)）代謝組學(xué)用于更全?的分析和代謝物的相對定性和定量。靶向方法具有準(zhǔn)確定性定量測定目標(biāo)物質(zhì)的優(yōu)點，但它的局限性在于部分代謝組學(xué)覆蓋，有可能遺漏其他類別的代謝物導(dǎo)致目標(biāo)代謝通路的不完整。非靶向代謝組學(xué)方法的分析雖然不需要任何預(yù)先存在的知識或假設(shè)，覆蓋的代謝物種類更全面，但因其鑒定參照往往來自于商業(yè)庫，或受到生物樣本基質(zhì)效應(yīng)的影響，導(dǎo)致其定性和定量的準(zhǔn)確性不能得到有效保證。

代謝組學(xué)樣品制備包括代謝淬滅和代謝物提取。代謝物需要通過氣相色譜（GC）、液相色譜（LC）、毛細(xì)管電泳（CE）進行分離，或者可以直接在直接進樣（DI）和質(zhì)譜成像（MSI）中進行離子化?？梢允褂貌煌碾x子化技術(shù)：電子碰撞離子化（EI）、化學(xué)離子化（CI）、大氣壓化學(xué)離子化（APCI）、電噴霧離子化（ESI）、基質(zhì)輔助激光解吸離子化（MALDI）?？梢赃x擇單一（MS）或串聯(lián)（MS/MS）質(zhì)量分析儀器來根據(jù)離子的m/z值進行分離：四極桿（Q）、四極離子阱（QIT）、飛行時間分析儀（TOF）、傅里葉變換離子回旋共振（FTICR）、軌道阱（OT）。數(shù)據(jù)處理包括m/z值的轉(zhuǎn)換、基線過濾、歸一化和鑒定等。

圖2. 基于質(zhì)譜（MS）的代謝組學(xué)工作流程

代謝流分析（metabolic flux analysis, MFA）

代謝組學(xué)是一種可靠的技術(shù)，能夠識別與腫瘤相關(guān)的代謝特征；但往往無法揭示代謝通路的可塑性和動態(tài)性，僅提供了癌細(xì)胞代謝的靜態(tài)快照。代謝流分析（MFA）利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的底物可以通過追蹤下游代謝產(chǎn)物中特定原子的同位素富集情況來確定通量速率，從而真正連接組學(xué)分析和表型（圖3）。如圖3所示，第一步是設(shè)計實驗，包括通過計算模擬確定最佳示蹤劑以獲得最高通量分辨率和底物標(biāo)記。在穩(wěn)定同位素示蹤劑的給予后，樣品會被分析其同位素標(biāo)記和外部速率，外部速率考慮了底物的吸收和產(chǎn)物的分泌。代謝物的標(biāo)記可以通過質(zhì)譜（MS）或核磁共振（NMR）來測量，并整合到代謝網(wǎng)絡(luò)模型中，標(biāo)記測量要適應(yīng)模型，并包括所有相關(guān)反應(yīng)及其相應(yīng)的碳原子轉(zhuǎn)換。

圖3. 代謝流分析（MFA）的實驗工作流程

細(xì)胞外通量分析（extracellular flux analysis, EFA）

細(xì)胞外通量分析（EFA）是利用Agilent Seahorse XF分析儀作為領(lǐng)先技術(shù)的一種方法。它是廣泛定量活細(xì)胞、器官樣或組織的生物能活性的最常用和可行的方法（圖4）。簡而言之，EFA通過定量測量線粒體電子傳遞速率（被稱為線粒體氧化磷酸化作用）的氧消耗速率（OCR），以及通過乳酸生成的細(xì)胞外酸化速率（ECAR）來衡量糖酵解的結(jié)果。該儀器通過從微孔板中的細(xì)胞單層中取少量培養(yǎng)基（僅幾微升）實時測量OCR和ECAR。兩個安裝在光纖探針中的傳感器用于在幾分鐘內(nèi)定量測量氧氣水平和培養(yǎng)基pH值，然后軟件外推OCR（pmol/min）和ECAR（mpH/min）的定量結(jié)果。

關(guān)鍵的代謝途徑控制著癌細(xì)胞的生長，可以通過EFA進行檢測。（圖4）通過連續(xù)注射葡萄糖、奧利司他霉素和2-脫氧葡萄糖（2-DG）進行糖酵解應(yīng)激試驗，以獲取糖酵解、糖酵解能力、糖酵解儲備和非糖酵解酸化測量的結(jié)果。ECAR代表細(xì)胞外酸化速率。糖酵解速率試驗報告了多個關(guān)鍵參數(shù)，如基礎(chǔ)糖酵解、通過羅特儂和抗霉素A抑制線粒體呼吸而實現(xiàn)的代償性糖酵解。質(zhì)子外流速率（PER）是糖酵解過程中排出細(xì)胞外介質(zhì)的質(zhì)子的定量測量。細(xì)胞線粒體壓力試驗通過定量測量氧氣消耗速率（OCR）來測量線粒體呼吸。細(xì)胞依次接觸奧利司他霉素、4-(三氟甲氧基)苯基腙氰和羅特儂和抗霉素A，從而測量基礎(chǔ)呼吸、最大呼吸和呼吸潛力（spare respiratory capacity）。底物氧化壓力試驗通過與標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞線粒體壓力試驗結(jié)合使用特定抑制劑來測量長鏈脂肪酸（LCFAs）、葡萄糖/丙酮酸和谷氨酰胺作為主要底物對線粒體代謝的貢獻。

圖4. 通過細(xì)胞外通量分析 (EFA)檢測的控制癌細(xì)胞生長的關(guān)鍵代謝途徑

單細(xì)胞代謝分析（Single-cell metabolic analysis, SMA）

截至目前，關(guān)于癌癥代謝的大多數(shù)研究結(jié)果是通過細(xì)胞培養(yǎng)模型和從體內(nèi)獲取的腫瘤樣本中檢測獲得的。代謝組學(xué)和EFA分析的一個最大限制是它們不能同時進行代謝狀態(tài)和表型分析。每個細(xì)胞的結(jié)果都受到遺傳和環(huán)境因素的影響，因此與細(xì)胞種群的異質(zhì)性很難兼容。此外，標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基與人體生理營養(yǎng)環(huán)境并不相似，腫瘤微環(huán)境中的營養(yǎng)物可用性明顯調(diào)節(jié)代謝依賴性。單細(xì)胞測序scRNAseq的出現(xiàn)為以高分辨率檢測腫瘤的基因組特征提供了前所未有的機會。檢測代謝基因表達變化是擴展對癌癥代謝重組的理解和識別代謝特征的有力工具。通過微流控裝置將收集在亞微升級液滴中的單個細(xì)胞分選到多孔板上；在細(xì)胞溶解后，通過條形碼對細(xì)胞進行編碼，以將測序數(shù)據(jù)分配給每個細(xì)胞（圖5）。這一技術(shù)進步得益于能夠捕獲和測序極少量的RNA。scRNAseq研究顯示，惡性細(xì)胞普遍上調(diào)幾乎所有功能類別的代謝途徑相關(guān)基因，表明其具有高度的代謝可塑性，使其能夠適應(yīng)不同的遺傳和環(huán)境因素。代謝基因的整體轉(zhuǎn)錄重組表明，癌細(xì)胞為這些基因的表達保留了更多的轉(zhuǎn)錄資源，從而增加了大多數(shù)代謝反應(yīng)的通量。

單細(xì)胞代謝組學(xué)(SCM)提供了生物系統(tǒng)中細(xì)胞代謝的所有代謝物、中間體和最終產(chǎn)物的快照，解碼細(xì)胞內(nèi)的生化異質(zhì)性。制備單細(xì)胞樣品的最大挑戰(zhàn)是避免或至少減少樣品處理對細(xì)胞代謝的影響。單細(xì)胞樣品制備的標(biāo)準(zhǔn)方法是熒光活化細(xì)胞分選(FACS)和微流體陣列，保持完整的細(xì)胞形態(tài)或通過原子力顯微鏡(AFM)探針提取，探針中只保留細(xì)胞的代謝物。細(xì)胞代謝應(yīng)被淬滅，并可通過基于質(zhì)譜的技術(shù)進行分析(圖5b)。先前針對單細(xì)胞水平代謝基因的基因組分析表明，個體惡性細(xì)胞具有在大量腫瘤研究中未觀察到的代謝活性升高和變異。相對于scRNAseq，SCM有助于解剖細(xì)胞異質(zhì)性，因而在腫瘤疾病和轉(zhuǎn)移檢測、精確藥物設(shè)計、藥物評估和毒性方面尤其有用。此外，SCM還可用于分析罕見或循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctc)以及癌癥亞型區(qū)分和新療法開發(fā)。

目前已經(jīng)有幾種基于細(xì)胞計數(shù)的方法將代謝分析與單細(xì)胞表型相結(jié)合。熒光代謝探針和代謝物類似物可以通過流式細(xì)胞術(shù)或顯微鏡進行分析，從而實現(xiàn)單細(xì)胞分辨率，它們通常用于代謝預(yù)篩選分析，因為它們快速，相對便宜，并且易于適應(yīng)不同的實驗設(shè)置。例如:2- nbdg是一種監(jiān)測活細(xì)胞中葡萄糖攝取的熒光指示劑;BODIPY用作多種熒光磷脂的合成前體;CM-H2DCFDA是細(xì)胞中ROS的有用指示物;半胱氨酸-異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)物監(jiān)測氨基酸的吸收和積累;單胺尸體堿(MDC)追蹤自噬液泡。

一種基于流式細(xì)胞術(shù)的創(chuàng)新方法可以用單細(xì)胞分辨率分析能量代謝(圖5c)。單細(xì)胞能量代謝分析翻譯抑制(SCENITH)基于代謝依賴的翻譯率和嘌呤霉素并入新生蛋白來測量代謝譜。用靶向抑制劑孵育給定樣品，可以從功能上估計葡萄糖和線粒體依賴性、糖酵解、脂肪酸和氨基酸氧化能力。嘌呤霉素化檢測可以與多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)分析相結(jié)合，從而分析單細(xì)胞復(fù)合物和異質(zhì)樣品。到目前為止，SCENITH已應(yīng)用于分析離體全血和人類腫瘤活檢。有趣的是，對腎癌和腫瘤旁組織進行SCENITH與scRNAseq聯(lián)合分析，成功地將代謝譜和代謝基因表達聯(lián)系起來。此外，SCENITH可用于許多其他腫瘤設(shè)置和生理病理條件，包括理解與代謝和氧化還原失衡具有重要和多重聯(lián)系的細(xì)胞死亡途徑。

2007年，Scott D. Tanner受到流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)的啟發(fā)，發(fā)明了質(zhì)量細(xì)胞術(shù)，也被稱為飛行時間細(xì)胞術(shù)(CyTOF)，這是高維和高通量蛋白質(zhì)(和代謝)單細(xì)胞分析最有前途的技術(shù)(圖1)。CyTOF使用非生物可利用的金屬同位素，具有簡明的質(zhì)譜參數(shù)，以取代標(biāo)準(zhǔn)的熒光標(biāo)記。通常用于流式細(xì)胞術(shù)?？赏瑫r研究多達50個參數(shù)，克服了與重疊發(fā)射光譜相關(guān)的所有缺陷，這些缺陷通常用于基于熒光的分析(圖5d)。此外，還有一種利用代謝成像來定量組織切片內(nèi)單細(xì)胞酶活性的新方法——通過原位脫氫酶活性測定，定量測定在主要代謝途徑中催化關(guān)鍵步驟的五種酶的活性[PPP中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)，糖酵解中的甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，乳酸發(fā)酵中的乳酸脫氫酶(LDH)，以及TCA循環(huán)中的IDH和SDH]，以區(qū)分和表征細(xì)胞群體 (圖5e)。

圖5. 腫瘤微環(huán)境（TME）研究的先進技術(shù)的全局概述

精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的代謝組學(xué)和生物信息學(xué)方法

在過去的二十年里，已經(jīng)提出了用于基于MS和NMR 的代謝組學(xué)的更先進的數(shù)據(jù)處理技術(shù)，包括用于峰檢測和對齊的軟件（例如 XCMS、MZmine2、Open?MS、MS?DIAL、eRah、ADAP?GC , BinBase)，它可以從大而復(fù)雜的數(shù)據(jù)中進行光譜注釋和識別。統(tǒng)計分析，包括單變量和多變量分析，用于識別顯著表達的代謝物，然后將其與生物學(xué)相關(guān)聯(lián)，通過使?專門工具（例如KEGG）執(zhí)行的功能分析過程，將代謝物映射到已知的生化途徑。最后，代謝組學(xué)數(shù)據(jù)可以與其他組學(xué)數(shù)據(jù)（轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)或微生物組）整合，以充分描繪?物系統(tǒng)的復(fù)雜性。

事實上，結(jié)合多組學(xué)數(shù)據(jù)的問題更多地與設(shè)計適當(dāng)?shù)牟呗杂嘘P(guān)，而不是開發(fā)新的分析工具。事實上，關(guān)聯(lián)分析和分類器的開發(fā)已經(jīng)成功地應(yīng)用于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，就像以前在基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)上用于區(qū)分腫瘤亞型一樣。與全基因組關(guān)聯(lián)研究類似，對生物體液或組織進行了代謝組學(xué)分析，目的是確定對不同疾病的易感性標(biāo)記，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌和胰腺癌。然而，這些研究僅限于樣本生物學(xué)的單一維度，需要在獨立的隊列中進行驗證，并且只能找到模式與特定生理病理狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)，這并不能證明因果關(guān)系，應(yīng)從關(guān)聯(lián)研究轉(zhuǎn)向確定癌癥中不同水平的基因表達和代謝調(diào)節(jié)及其失調(diào)之間的因果關(guān)系和復(fù)雜相互關(guān)系。

結(jié)論與展望

本綜述討論的最新技術(shù)和概念進展，從代謝組學(xué)到單細(xì)胞方法，使代謝成為癌癥生物學(xué)研究中最有活力和最富有成果的領(lǐng)域之一。代謝組學(xué)是推動這一變革的主要技術(shù)，已經(jīng)展示出在腫瘤學(xué)臨床應(yīng)用中對癌癥研究未來產(chǎn)生巨大潛力的能力。這些分析仍需要更深入地了解定性和定量結(jié)果如何反映人體生理的真實情況，以及生物體液中的代謝物組合在多大程度上反映了腫瘤的代謝環(huán)境。

過去40年來，新技術(shù)的發(fā)展、更易獲取的、更強大和更高分辨率的能力推動了癌癥研究前所未有的進展。特別是高通量的單細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)為以細(xì)胞為分辨率研究癌癥生物學(xué)提供了前所未有的工具。這些代謝工具應(yīng)以互補的方式使用，將描述性研究與功能性研究相結(jié)合，為癌癥的研究、診斷和治療開辟創(chuàng)新途徑。通過結(jié)合這些技術(shù)，能夠擴展對腫瘤的理解，并為新的抗癌策略鋪平道路。

參考文獻

To metabolomics and beyond: a technological portfolio to investigate cancer metabolism. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2023.

繪譜幫你測

代謝流分析(Metabolic Flux Analysis，MFA)利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記特定的化合物，通過分析下游代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定同位素標(biāo)記模式，推算出該標(biāo)記代謝物在細(xì)胞內(nèi)或動物體內(nèi)代謝通路中的周轉(zhuǎn)速率、方向和分布規(guī)律，從而在動態(tài)水平上描述生物體的代謝流向和活性，被廣泛應(yīng)用于代謝機制研究。麥特繪譜擁有GC-MS與LC-MS兩大檢測平臺，可追蹤含13C和15N等被標(biāo)記物100+種，覆蓋糖酵解和TCA循環(huán)通路、磷酸戊糖途徑、氨基酸代謝、脂肪酸代謝、一碳代謝、核甘酸代謝通路等。截至2023年5月，我們已協(xié)助客戶與合作伙伴發(fā)表SCI文章300+篇，累計影響因子3000+，包括Science, Cell Metabolism, Immunity, Gut, Signal Transduction and Targeted Therapy, Science Translational Medicine等頂級期刊。獨家的檢測技術(shù)、全面的數(shù)據(jù)報告及專業(yè)科研級別的售后探討，助您科研探索之路不斷創(chuàng)新和突破。詳情請咨詢繪譜熱線400-867-2686，獲取詳細(xì)資料！

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